Science：细菌抵御噬菌体侵染的新机制

逆转录酶（RT）是一种能将RNA模板合成互补DNA（cDNA）的酶，广泛应用于生物技术中。近年来，研究发现与防御相关的逆转录酶（DRTs）在细菌抗病毒免疫中发挥关键作用。Song 等人发现了一种抗病毒机制：细菌逆转录酶 DRT9 能感知噬菌体感染引起的胞内 dATP 水平升高，并通过此信号合成富含 poly(A) 的单链 cDNA。这些重复的 poly(A) cDNA 分子可能通过结合并“俘获”噬菌体的单链 DNA 结合蛋白（SSB），从而干扰病毒复制。该发现不仅扩展了我们对逆转录功能的理解，还揭示了cDNA在细菌免疫防御中的意外作用，其机制与端粒酶介导的DNA延长类似。

引言

 逆转录酶（RT）能够利用RNA模板合成互补DNA（cDNA），广泛用于生物技术领域。近年来研究表明，原核生物中存在多种具有抗噬菌体功能的RT，例如与CRISPR相关的RT、重转座子（retrons）、自杀性感染（Abi）系统以及一些未被充分表征的群体（UGs）。新定义的一类称为“防御相关逆转录酶（DRTs）”，通常与非编码RNA（ncRNA）共存，已被系统划分为DRT1至DRT9九种类型，提示其在机制上具有多样性。此前仅有DRT2的抗病毒机制被明确，其通过滚环逆转录ncRNA，合成新的开放阅读框（neo genes）cDNA，从而赋予宿主抗噬菌体能力；但其他类型的机制仍不明确。

研究动机

不同RTs产物——由其相关ncRNA模板生成的cDNA——在抗病毒防御中发挥关键作用，凸显了RT机制的多样性。我们研究了大肠杆菌A178中的DRT9系统，其仅包含两个核心组分：上游ncRNA和一个RT。这两者均为抗噬菌体防御所必需。该ncRNA具备独特的二级结构，暗示其作用机制可能不同于先前已知系统。

研究结果

我们发现DRT9可与其上游ncRNA形成稳定的六聚体复合物，并通过“自杀性感染”机制使宿主生长停止，从而对一类广泛的噬菌体（尤其是Tevenvirinae亚科）产生强效防御。冷冻电镜结构显示，DRT9具有典型的RT折叠结构，其ncRNA则呈“树状”结构，具有六个发卡环。突变分析表明，ncRNA的二级结构（而非一级序列）对于防御功能至关重要。

 DRT9可在无外源引物的情况下，合成长度可达约5000个核苷酸、富含poly(A)的单链cDNA，高浓度dATP显著增强其cDNA产量。

为探究DRT9如何感知噬菌体感染，我们筛选出携带nrdA和nrdB基因突变（编码核苷酸还原酶RNR亚基）的噬菌体逃逸突变体。RNR的过表达增加了胞内dATP水平，触发DRT9活化并在体内合成poly(A)-rich cDNA。RNA测序显示在DRT9激活状态下，编码单链DNA结合蛋白（SSB）的基因表达显著上调。过表达T4噬菌体的SSB蛋白可抑制DRT9介导的防御，并恢复噬菌体复制能力。

进一步研究表明，DRT9生成的poly(A)-rich cDNA可直接与T4 SSB蛋白结合。综上，这些缺乏二级结构的cDNA分子可能通过“诱饵”机制结合并封闭SSB蛋白，从而干扰噬菌体复制过程。

结论

本研究揭示了DRT9系统的一种新颖抗病毒机制：噬菌体感染引起的胞内dATP升高激活DRT9，进而合成富含poly(A)的长链单链cDNA。这些cDNA缺乏二级结构，可能作为分子“诱饵”，结合并隔离噬菌体关键复制蛋白SSB，从而抑制病毒复制。该发现展示了原核RT机制的多样性，拓宽了我们对逆转录生物学功能的理解，同时也为开发基于DRT9的生物技术工具提供了结构基础。

                                                   由富含poly(A)的长链cDNA合成介导的抗病毒免疫机制

细菌的DRT9系统由逆转录酶DRT9和非编码RNA（ncRNA）组成。噬菌体感染通过其编码的核苷酸还原酶NrdAB复合物提升胞内dATP浓度，从而激活DRT9合成富含poly(A)的长链单链cDNA。这些cDNA可能通过“俘获”噬菌体复制所必需的单链DNA结合蛋白（SSB），从而干扰噬菌体的增殖。

摘要

最近发现原核防御相关逆转录酶（DRTs）具有抗病毒功能，但其具体机制仍不清楚。本研究发现，DRT9可与其上游非编码RNA（ncRNA）形成六聚体复合物，通过诱导细胞生长停滞实现抗噬菌体防御。当噬菌体感染发生时，其编码的核苷酸还原酶NrdAB复合物提升胞内dATP水平，从而激活DRT9合成富含poly(A)的单链cDNA，这些cDNA很可能通过结合噬菌体关键复制蛋白SSB来抑制其复制。我们还解析了该复合物的冷冻电镜结构，阐明了其合成机制。本研究揭示了RT抗病毒机制的多样性，并为发展DRT9相关生物技术工具提供了基础。

研究人员首先在大肠杆菌细胞内表达包含逆转录酶DRT9和非编码RNA(ncRNA)的DRT9系统，发现其通过流产感染(Abortive Infection, Abi)策略抵抗多种噬菌体的侵染。随后，研究团队利用冷冻电镜技术成功解析了DRT9与ncRNA的整体结构，DRT9-ncRNA整体呈现一个双层六聚体形式，其编码的ncRNA呈现出独特的“树状结构”。进一步的突变实验表明DRT9的多聚体状态及ncRNA的结构特征（而非具体序列）对其发挥防御功能至关重要。

同时，研究人员发现在高浓度dNTP和Mg²⁺条件下，DRT9能够合成超过1000nt的单链cDNA且不需要额外加入引物。通过深入的结构分析，研究人员认为ncRNA向外翻转的U124位碱基在cDNA合成过程中至关重要，并且只需要高浓度的dATP就足以启动cDNA的合成。为了揭示DRT9合成cDNA的序列特征，研究人员运用Illumina二代测序和PacBio SMRT三代测序技术，并结合Southern blot和UPLC-MS分析证实DRT9合成的cDNA为长链的poly-A，长度可达几千核苷酸。

为阐明DRT9系统识别何种噬菌体入侵的信号，研究人员通过噬菌体逃逸实验发现携带有nrdA和nrdB突变（编码核糖核苷酸还原酶RNR亚基，能将核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸）的噬菌体能够逃逸DRT9系统。进一步实验表明当T4噬菌体入侵时，其NrdAB复合物将迅速升高胞内dNTP含量，从而激活DRT9系统，而当NrdAB发生突变时，胞内dNTP水平并没有显著变化，从而使噬菌体能够逃逸DRT9系统的识别。这些结果表明了DRT9通过感知噬菌体侵染导致的dATP浓度升高而被激活。

为研究DRT9系统如何干扰噬菌体的增殖，研究人员通过转录组测序分析发现当DRT9系统存在时，侵染噬菌体与DNA复制相关的基因显著上调，尤其是编码单链DNA结合蛋白SSB (single-stranded DNA-binding protein, SSB) 的基因。噬菌体的SSB蛋白在噬菌体基因组复制和转录过程中发挥了重要作用，进一步的生理实验也表明，当过表达SSB蛋白时，DRT9系统失去了对噬菌体的防御能力。这些结果表明DRT9合成的长链poly-A cDNA“扣押”了噬菌体的SSB蛋白，从而抑制噬菌体正常增殖。

综上，噬菌体侵染细菌时，其编码的核糖核苷酸还原酶NrdAB促使宿主细胞内dNTP浓度迅速升高，为噬菌体基因组DNA合成提供原料。细菌DRT9免疫系统通过感知细胞内dATP浓度的升高被激活，逆转录合成大量富含poly-A序列、长度可达数千个核苷酸的单链cDNA。这些长链poly-A-rich cDNA因缺乏二级结构，成为单链DNA结合蛋白（SSB）的优良结合底物，从而通过扣押噬菌体复制必需的SSB蛋白，阻断噬菌体的复制，从而保护细菌。这一发现不仅拓展了我们对细菌免疫策略的理解，也丰富了对逆转录酶生物学功能的认识，建立了原核逆转录酶与真核端粒酶之间的分子联系，并为基于DRTs的生物技术工具开发提供了重要基础。