结核分枝杆菌定量及耐药基因检测

背景

结核病(tuberculosis，TB)是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，这种古老的传染病曾在全世界广泛分布，其流行可持续数个世纪，被称为“白色瘟疫”。结核分枝杆菌可侵犯全身各器官而发病，但主要侵犯肺部，以肺结核最为常见。呼吸道是结核菌主要的传播途径，约95%的结核感染者是经呼吸道传播。由于人体对结核分枝杆菌易感、感染剂量较低，因此结核分枝杆菌易于在人际间传播。目前，结核病仍是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题。结核病是一种高度传染性的空气传播疾病，世界上没有任何一个社会可以完全避免结核病，但大多数病例出现在亚洲(58%)和非洲(28%)。尽管结核病在20多年前就被宣布为一种普遍的公共卫生紧急情况，但结核病死亡人数仍然高得令人无法接受，因此巩固了它作为一个主要全球健康问题的地位。控制结核病的流行受到许多因素的阻碍，其中最主要的是结核分枝杆菌耐药菌株的进化。在与人类宿主共存了数百年之后，这种细菌进化出了复杂的免疫逃逸和传播策略，目前存在多药耐药结核病(MDR-TB)和极端耐药结核病(XDR-TB)。对多药耐药结核病和极端耐药结核病患者的治疗需要长期使用昂贵且毒性更大的抗生素。临床医生在治疗多药耐药结核病和极端耐药结核病患者时的观察经常包括对治疗有反应的数周后出现矛盾的炎症发作。

结核分枝杆菌具有许多特殊的微生物学特征，这些特征对其在宿主体内的生存和传播具有重要意义。首先，结核分枝杆菌的细胞壁结构独特，其主要成分为短链脂质和长链脂质，这些脂质结构使其对外部环境有一定的耐受能力，有利于在宿主内存活。其次，结核分枝杆菌具有慢生长的特性，其繁殖周期相对较长，通常需要数周至数月的时间才能形成一个完整的分裂体。这使得结核分枝杆菌对抗生素的敏感性下降，导致治疗难度增加。此外，结核分枝杆菌还有强烈的侵袭性和耐酸性，能够在宿主体内形成坚固的病灶，并且能够在酸性环境中存活，这些特性使得结核病难以治愈。

传统诊断方法主要包括临床症状观察、胸部X线检查、痰液涂片检测和培养法。这些方法存在一定的局限性，如不能准确检测低浓度结核分枝杆菌、不能鉴定耐药菌株等。因此，分子生物学诊断方法逐渐成为结核病诊断的重要手段。

在分子生物学诊断方法中，实时定量PCR 作为一种高灵敏度、高特异性的检测方法，已被广泛应用于结核分枝杆菌的检测。然而，传统的实时PCR技术在检测低拷贝数目的结核分枝杆菌时存在一定的局限性。为了克服这一问题，数字PCR技术(dPCR)应运而生。数字PCR技术通过将反应体系分割为数十万至数百万个微小反应体积，使得每个反应只包含极少的目的DNA分子，从而实现了对低拷贝数目的DNA的高度灵敏度和准确性的检测。据世界卫生组织《2020年全球结核病报告》估计，2019年我国结核病发病人数为83.3万，占全球的8.4%，位居全球第三位。

目前，伴随着耐多药结核病（multidrug⁃resistant tuberculosis，MDR⁃TB）和广泛耐药结核病患者的日益增多结核病的防控工作面临前所未有的挑战。世界卫生组织2022年结核病报告显示，2021年全球新发耐多药和利福平耐药结核病45万例，而其治疗成功率仅为60%，病死率达16%。我国是耐多药和利福平耐药肺结核（multidrug⁃resistant and rifampicin⁃resistant pulmonary tuberculosis， MDR/RR⁃PTB）高负担国家之一。在科学发展的今天，除了卡介苗以外还没有更有效的疫苗可以用于临床，所以化学治疗仍然是结核病治疗的主要手段。鉴于抗结核药物的研发难度大、研究周期长，自1963年利福平的问世以来，过去40多年内抗结核新药的研究处于沉寂状态。直到 2012年，贝达喹啉(bedaquiline)获得美国FDA的批准，用于耐多药结核病的治疗。因此，目前结核病防控的主要手段，是通过快速检测结核病及其耐药性，在现有的药物基础上合理选择化疗方案，以减少耐药的发生和传播；早诊断、早隔离、早治疗是减少肺结核发病和死亡的关键环节，诊断的滞后导致个体化治疗的延误和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的传播。

结核分枝杆菌

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起人类结核病的主要病原体，归属于结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)。MTBC除MTB外，还包括牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)、M.caprae、M.canetti和M.pinnipedii。MTBC成员有相同的16SrRNA序列(除了M.canettii)和超过99.9%的核酸水平的一致性。它们均能引起结核病，但感染的宿主的范围不同。

结核分枝杆菌的基本形态呈细长略弯杆状，呈单个或分支状排列，生长速度缓慢，18~24小时分裂一次。由于结核分枝杆菌的细胞壁富含脂质，不易着色但可在石炭酸的辅助下被碱性复红着色，着色后能抵抗盐酸乙醇的脱色，此特性称为“抗酸染色”。临床上最早应用痰涂片显微镜检测结核分枝杆菌就是基于它的抗酸染色特性。随着DNA测序技术的快速发展，第一株结核分枝杆菌H37Rv的全基因组序列被公布，结核分枝杆菌的基因组全长为4.4Mbp，G/C含量高达65.6%，共有3924个开放阅读框被认为编码蛋白质。H37Rv基因方向没有明显的偏向性，59%的基因转录方向与复制叉移动方向一致。

结核分枝杆菌缺乏外毒素、内毒素和侵袭性酶类，基因组中无毒力岛，也不携带质粒。结核患者的临床症状和体征表现中除咳嗽是慢性肺部炎症的症状外多为宿主的免疫反应所致，表现为发热、消瘦，是一种慢性的消耗性疾病。因此，目前认为结核分枝杆菌的致病性可能主要与其菌体成分、具体特殊构造、代谢物质的毒性、在宿主体内大量繁殖引起的炎症以及机体应答的免疫损伤等因素有关。

传统检测方法

结核病实验室检查方法按方法学分类包括以下3种。（1）病原学诊断方法：如涂片显微镜检查与培养； （2）免疫学诊断试验：如结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）、结核抗体检测与γ干扰素释放试验（interferonγ release assay，IGRA）；（3）分子生物学方法。

1. 涂片显微镜检查

用于涂片显微镜检查的临床标本，包括但不限于呼吸道标本(痰、咽喉拭子、支气管肺泡灌洗液支气管毛刷等)胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液、胃液、脓液(分泌物、穿刺液等)穿刺物、病理组织、粪便等。对于痰标本，采用5%次氯酸钠液化后离心浓缩，沉淀物涂片染色可有效增加阳性率，对于未来采用分子生物学或培养等手段的实验室非常重要。对于体液标本，含有的MTBC的数量很少涂片本身价值非常有限，一般推荐浓缩后涂片。但是浓缩过程存在生物安全风险，且MTBC的比重与水相近，有一部分MTBC会存在于上清液中，离心未必有效提高检出率。因此在实验室有条件时应尽可能采用更灵敏的手段进行MTBC检测。目前较为实际的方法是，对肉眼所见清亮的体液标本优选细胞离心甩片机浓缩制片，也可使用普通离心机。对于脑脊液，标本量充足时建议至少用5ml标本。当标本混浊、血性或脓性，可直接涂片不离心浓缩的标本在进行半定量报告时,建议备注为“浓缩标本”。胸腔积液时,优选胸腔活检组织用于MTBC微生物学检查。

涂片镜检具有操作简单、检测迅速、对硬件设施要求不高等优点，适合基层开展。但该方法敏感度较低，特别是儿童、艾滋病与肺外结核病患者。此外，涂片镜检的缺点还包括：不能区分菌体的死活，无法开展后续的药物敏感性试验；只能检测标本中是否存在分枝杆菌，不能区分MTB和NTM，检测结果阳性还需进一步明确。我国“MTB分离株”中最后鉴定为NTM的比例约22.9%。很多NTM可呈现一定程度的抗酸性，其他如红球菌属、诺卡菌属、米克戴德军团菌、隐孢子虫属的包囊、等孢子虫、环孢子虫和微孢子菌属孢子，也有某些程度的抗酸性。<10%的快生长分枝杆菌有抗酸性但不被荧光素着色。

2.免疫学诊断试验

（1）结核抗体检测：MTBC感染机体后生长繁殖，产生代谢产物，刺激免疫系统产生特异性抗体，检测这些抗体有助于结核病的诊断。但该方法特异度与灵敏度均较差，近年来已不推荐作为结核病的实验室检查方法。

（2）γ干扰素释放试验（interferonγ release assays，IGRA）：近年用于结核病辅助诊断的新型免疫学方法，通过MTBC特异抗原（主要为早期分泌性抗原靶6和培养滤液蛋白10，也有的试剂包括 TB7.7.）刺激T淋巴细胞释放γ干扰素来检测是否存在结核感染。部分NTM，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏氏分枝杆菌与MTBC存在相近的特异抗原片段1（region of difference 1，RD1），可造成假阳性，但是也有研究并未发现这种干扰。

3．病原学检测

（1）MTB培养：作为结核病诊断金标准，分枝杆菌培养是结核病诊治的重要检测手段。通过培养获得的菌株可用于后续的药敏检测、基因测序、进化分析等。目前培养方法最低检出限约为10~100CFU/ml，固体培养敏感度约为67%，Bactec MGIT 960 敏感度约80%，特异度均约98%，高于抗酸染色。MTBC生长缓慢，因此对有菌部位来源的标本和培养过程均需去污染处理。

分子生物学检测

分子生物学方法可在2h内得到结果，相比传统培养方法明显缩短了检测时间，提高了敏感度和特异度。同时，分子生物学方法可进行菌种鉴定和耐药基因检测，利于结核病的快速诊断和及时治疗。目前实验室开展的分子生物学检测包括实时荧光定量聚合酶链反应、Gene Xpert MTB/RIF、线性探针分析（line probe assays，LPA）以及恒温扩增技术等，主要靶标为MTB基因组中保守的管家基因（如rpoB、 16s rRNA和IS6110）。

数字PCR技术作为新兴的临床检测技术，与以往的技术比较，定量核酸的方法不同，不依赖标准曲线、高灵敏度、高特异度等诸多优点，与实时荧光定量PCR比较，各方面均有不同。荧光定量技术是针对整个反应扩增过程实时采集并分析荧光信号，生成扩增曲线，然后利用CT值与标准曲线进行核酸水平的定量分析。在临床检测中，实时荧光定量PCR存在一定的局限性：对标本类型与核酸模版水平要求相对较高，目前主要应用于血液、尿液与肺泡灌洗液等背景简单的标本中，在检测如粪便、痰液等背景复杂的标本时，由于标本与标准品间背景不同为检测引入误差；部分标本中存在反应抑制剂，如血液抗凝剂、福尔马林等，降低了扩增效率，影响CT值；标本目标核酸水平低于检测限等因素均会影响实时荧光定量PCR技术的精确度与灵敏度，且各标准品水平存在差异，不仅为实验引入新误差，还导致各实验室间数据可交换性差。

检测痛点分析

诊断时间长：传统的痰培养和药敏试验仍然是部分地区的主流检测手段，但这些方法的检测周期较长（通常需要数周），严重影响了早期诊断和治疗方案的及时制定。

检测设备和技术门槛高：如Xpert MTB/RIF的检测技术其设备昂贵、技术复杂，许多基层医疗机构难以普及。

检测成本高：全基因组测序的成本较高，尤其是对于耐药基因的多靶点检测，导致许多经济欠发达地区难以承受，使得这些技术的推广受限。

低负荷样本的灵敏度问题：在低负荷样本（如痰液质量差、HIV感染者等免疫抑制患者）中，传统PCR方法（如qPCR、LPA）往往难以达到足够的灵敏度，容易漏诊。

标准化和质控问题：尽管许多分子检测技术在大城市和大型医院应用较为广泛，但在一些中小型实验室，缺乏标准化操作和严格的质量控制，导致检测结果的准确性和一致性存在问题。

对耐药基因异质性的检测不足：耐药结核往往表现为多重突变或异质性耐药，部分检测技术（如qPCR、LPA）难以同时检测多个突变位点，可能导致耐药性低估。

数字PCR检测结核杆菌优势

1. 数字PCR能够通过对目标DNA进行分割和单分子水平的定量分析，实现对结核分枝杆菌的精确检测。这在低菌负荷（如潜伏结核或早期感染）或传统检测方法灵敏度较低的情况下，尤其具有优势。

低菌负荷样本的检测：传统的实时荧光定量PCR在检测低菌负荷样本时，灵敏度可能受到限制，而dPCR能够有效地对低浓度样本中的MTB进行检测。dPCR通过对样本进行分区，可以将样本中的MTB DNA分成多个反应单元，从而降低背景噪声、提高灵敏度。

潜伏结核感染的诊断：对于潜伏性结核感染者（latent TB infection, LTBI），菌负荷通常非常低。研究显示，dPCR能够在更低的检出限下，有效定量检测潜伏性结核感染者体内的MTB DNA，有助于早期干预和治疗。

2. 耐药基因检测中的应用dPCR还在结核分枝杆菌耐药基因突变检测中展示了广泛的应用，尤其是在精确区分野生型和突变型的基因位点上。结核分枝杆菌的耐药性通常与特定基因的突变相关，例如与利福平耐药相关的rpoB基因和与异烟肼耐药相关的katG或inhA基因突变。传统的检测方法如基因测序或qPCR有时无法区分低丰度突变，dPCR能够在混合样本中更精确地检测这些突变。

异质性突变的检测：在某些患者的样本中，可能存在野生型和突变型的混合群体，特别是耐药突变处于低频时，传统的检测方法可能无法有效检出。dPCR能够通过对单个DNA分子的检测，实现对低频突变的精准检测，尤其适用于检测耐药性较弱、突变比例较低的样本。

多重耐药（MDR-TB）与广泛耐药（XDR-TB）结核的快速诊断：通过检测多重耐药结核分枝杆菌的rpoB、katG、inhA、pncA等基因的特定突变位点，dPCR可以帮助实现对耐药结核菌株的早期快速筛查，避免治疗失败或延误。

3. 非结核分枝杆菌（NTM）病诊断中的应用非结核分枝杆菌（NTM）广泛存在于环境中，且具有较高的异质性，许多NTM物种可引起不同类型的肺部感染或皮肤感染。由于NTM与MTB的临床症状类似，常规的培养检测耗时长且区分困难，因此，dPCR在NTM的快速鉴定和定量检测中展现出独特的优势。

区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌：dPCR可以通过检测特异性基因靶点，区分MTB与NTM，例如检测IS6110（MTB特异）和hsp65（NTM特异）等基因。该方法不仅提高了NTM检测的灵敏度，还能在样本中MTB和NTM共感染的情况下实现准确鉴别。

NTM病原体定量与治疗效果监测：dPCR可以精确量化NTM菌株的负荷，帮助评估患者治疗前后的病原体清除情况，尤其适用于NTM肺部感染等慢性疾病的长期治疗监测。

4. 数字PCR在耐药性监测与治疗评估中的应用——治疗中耐药性突变的监测：通过dPCR检测患者治疗过程中耐药基因的突变情况，可实时监控耐药菌的出现及扩散，帮助调整治疗方案。特别是对于长期治疗的患者，如多药耐药或广泛耐药的结核患者，dPCR能够及早发现耐药性菌株的扩增，从而避免治疗无效。

新型抗结核药物的研究和应用：随着新型抗结核药物（如贝达喹啉、利奈唑胺等）的出现，dPCR可以用于监测与这些药物耐药相关的基因突变，例如atpE和rv0678基因。对于这些新型药物的耐药性突变检测，dPCR可作为一种高精度工具，有助于个体化治疗方案的制定。

数字PCR作为一种高灵敏度、高特异性的定量检测技术，已在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测和耐药基因监测中显示了巨大的应用潜力。通过dPCR，不仅能够在低菌负荷样本中精确定量结核分枝杆菌，还可以高效检测耐药基因的异质性突变。对于非结核分枝杆菌感染的诊断和治疗监测，dPCR同样展现出其独特的优势，能够快速区分NTM与MTB，精准定量病原体，进而帮助优化治疗策略。