引言：肠出血性大肠杆菌的威胁

肠出血性大肠杆菌（EHEC）是一种主要的腹泻致病菌，它能够引发血性腹泻、出血性结肠炎，甚至导致超过90%的溶血性尿毒综合征。这种细菌通过其III型分泌系统（T3SS）将多种毒性效应子传递到宿主细胞中，从而干扰宿主的免疫系统。其中，NleL（也称为EspX7）就是这样一个效应子，它在体外展现出类似E3泛素连接酶的活性，能够泛素化人类的JNK蛋白，促进EHEC相关的黏附和擦除病变。然而，NleL是否还通过其他微生物-宿主相互作用来促进EHEC感染，一直是个未解之谜。

NleL对宿主NF-κB信号通路的破坏

NF-κB信号通路是宿主免疫反应中的关键调节通路，许多细菌效应子都将其作为攻击目标。研究人员发现，NleL能够显著抑制TNFα介导的p65磷酸化，减弱IKK磷酸化和IκBα降解，从而阻止p65从细胞质转移到细胞核。此外，NleL还能抑制TNFα诱导的NF-κB荧光素酶活性。这些结果表明，NleL能够抑制NF-κB信号通路的激活。

NleL的E3泛素连接酶活性对其破坏宿主NF-κB信号通路至关重要。Cys753是NleL E3活性的关键位点，Cys到Ala的替换（C753A）会破坏其E3活性。研究发现，C753A突变体损害了NleL抑制NF-κB荧光素酶活性和p65核转移的能力，这表明NleL的E3活性是其破坏宿主NF-κB信号通路所必需的。

NleL与宿主蛋白的相互作用

研究人员假设NleL可能靶向NF-κB通路中的某些分子。通过使用重组GST-NleL蛋白与HEK293T细胞裂解液中的相互作用蛋白进行共沉淀实验，研究人员发现NleL能够与TRAF2相互作用。进一步的实验表明，NleL与TRAF2的相互作用不依赖于其E3活性，且TRAF2的锌指结构域（87-264aa）主要负责与NleL的相互作用。

NleL能够体外和体内泛素化TRAF2，并且这种泛素化依赖于NleL的E3活性。研究人员通过质谱分析确定了TRAF2上11个潜在的泛素化位点，其中5个位点（K27、K119、K194、K201和K207）在NleL存在时被特异性识别。研究人员构建了一系列K到R的TRAF2突变体，发现K119R、K194R、K201R和K207R四个突变体显著降低了NleL介导的TRAF2泛素化。同时突变这四个残基（4KR）几乎完全消除了TRAF2的泛素化，表明它们是主要的泛素化位点。

NleL对其他TRAF蛋白和NF-κB通路组分的影响

TRAF家族有六个成员（TRAF1-6），它们在结构上相似。研究人员发现，NleL能够与所有TRAF蛋白相互作用，并且除了TRAF4外，NleL能够泛素化所有TRAF蛋白。特别是，NleL能够促进TRAF6的泛素化，但不能连接K63连接的泛素链。此外，NleL还抑制了TRAF5或TRAF6过表达诱导的NF-κB激活。

NleL还能够与NF-κB通路中的关键下游调节因子IKKα、IκBα和p65形成复合物。NleL能够泛素化IKKα和IKKβ，但不能泛素化p65、IκBα和其他NF-κB通路的重要组分。NleL抑制了IKKα或IKKβ过表达诱导的NF-κB激活，但对p50或p65过表达诱导的NF-κB激活没有影响。

NleL在EHEC感染中的作用

研究人员评估了NleL在EHEC感染过程中调节NF-κB信号通路的作用。由于缺乏合适的EHEC O157感染的小鼠模型，研究人员在上皮细胞中进行了感染实验。研究人员发现，与nleL突变体相比，野生型EHEC感染更强烈地抑制了p65的核转移。恢复NleL，而不是C753A，能够阻断p65的核转移。

结论：NleL的多靶点功能

综上所述，研究人员发现了NleL的多个宿主靶点。NleL不仅能够泛素化JNK蛋白以促进EHEC诱导的黏附和擦除病变，还能够靶向TRAF2、TRAF5、TRAF6、IKKα和IKKβ，破坏宿主的NF-κB信号通路。通过揭示细菌效应子的多靶点功能，这些研究有助于我们全面理解细菌效应子在破坏宿主防御中的强大能力。未来的研究需要进一步阐明这些主要发现的病理生理相关性。

参考文献：

Sheng Xiangpeng, Qing You, Hongnian Zhu, et al. 2020. "Enterohemorrhagic E. coli Effector NleL Disrupts Host NF-κB Signaling by Targeting Multiple Host Proteins." Journal of Molecular Cell Biology 12 (4): 318–321.