CRISPR-Cas基因编辑技术凭借其精准高效的特性，已成为基因治疗领域的“明星工具”。从Vertex Pharmaceuticals的CASGEVY™获FDA批准用于治疗镰状细胞病（SCD）和输血依赖型β地中海贫血（TDT），到多项临床试验的积极进展，这项技术正加速向临床应用迈进。然而，近期发表在《Gene》期刊（2024年931卷）的一项研究，为其安全性敲响了警钟——CRISPR在编辑人类珠蛋白基因时，可能引发未预料的遗传重排，这一发现为基因编辑的临床应用增添了新的考量。

聚焦镰状细胞病：CRISPR编辑的“意外发现”

镰状细胞病是一种由β珠蛋白基因（HBB）单点突变引发的遗传性血液病。正常情况下，β珠蛋白基因第六位氨基酸对应的DNA序列为A，而突变后变为T，导致血红蛋白结构异常，红细胞呈“镰刀状”，引发贫血、疼痛危机等严重症状。CRISPR技术的出现为根治SCD带来希望，其原理是通过向导RNA（sgRNA）引导Cas9核酸酶在突变位点附近切割DNA，再借助细胞修复机制（如同源重组HDR）引入正确序列，实现基因校正。

但美国特拉华大学与ChristianaCare基因编辑研究所的研究团队发现，当CRISPR-Cas9在β珠蛋白基因的镰状细胞突变位点附近切割时，会出现一种奇特现象：δ珠蛋白基因（HBD）的一段特征序列（被称为“δ珠蛋白足迹”）会意外出现在β珠蛋白基因中。这一现象并非个例，而是CRISPR切割引发的遗传重排产物。

实验验证：无需模板，双链断裂是关键

为探究这一“基因足迹迁移”的机制，研究团队以K-562细胞为模型展开实验。K-562细胞源自慢性粒细胞白血病患者，携带多拷贝正常β珠蛋白基因，是研究珠蛋白基因编辑的理想工具。

研究人员设计了两种sgRNA（G5和G10），分别靶向β珠蛋白基因中靠近镰状细胞突变位点的区域（G5距突变仅1个碱基，G10距突变17个碱基），并构建CRISPR-Cas9复合物（RNP）。实验分为两组：一组加入72-mer单链寡核苷酸（ssODN）作为修复模板，另一组仅用RNP切割，不添加模板。72小时后，通过下一代测序（NGS）分析基因编辑结果。

结果令人意外：无论是否添加ssODN模板，β珠蛋白基因中均检测到δ珠蛋白足迹，且出现频率相近。这表明，这种遗传重排与外源模板无关，仅由CRISPR引发的双链DNA断裂（DSB）驱动。进一步实验中，研究团队使用Cas9变体（H840A nickase仅造成单链切口，dCas9无切割活性）重复实验，发现δ珠蛋白足迹完全消失。这证实，双链断裂是触发重排的核心因素——单链损伤或仅结合DNA而不切割，均无法引发这一现象。

图1 人类β珠蛋白插入缺失图谱及分布表^[1]

机制初探：等位基因转换或为幕后推手

为何β珠蛋白基因的断裂会吸引δ珠蛋白的序列“迁移”？研究团队推测，这可能与“等位基因转换”机制有关。人类珠蛋白基因家族位于11号染色体，δ珠蛋白与β珠蛋白基因位置相邻，序列高度相似（同源性约90%）。当CRISPR在β珠蛋白基因造成双链断裂时，细胞启动紧急修复程序，断裂处的单链DNA末端可能与邻近的δ珠蛋白基因序列互补配对，以δ珠蛋白基因为“临时模板”进行修复，最终将部分δ珠蛋白序列整合到β珠蛋白基因中。

这一过程类似于细胞在进化中形成的“应急修复策略”——当自身基因受损时，借用同源基因的序列应急。但在基因编辑场景下，这种“借用”变成了未预料的遗传重排。值得注意的是，这种重排是单向的：实验中未检测到β珠蛋白序列插入δ珠蛋白基因的情况，暗示δ珠蛋白向β珠蛋白的“序列迁移”可能具有方向性偏好。

临床启示：安全警钟与研究新方向

CRISPR技术的临床应用正快速推进，Vertex的CASGEVY通过编辑BCL11A基因重启胎儿珠蛋白表达，已获批用于治疗SCD和TDT。但本研究提示，即使是精准设计的CRISPR系统，也可能在序列相似的基因家族中引发意外重排。

“这并非否定CRISPR的价值，而是提醒我们需更深入理解其副作用” 。研究通讯作者Eric B. Kmiec强调，“在临床前研究中，除目标编辑效率外，还需监测邻近基因的重排风险，尤其是像珠蛋白这样的基因家族。”

未来，研究团队计划进一步探索重排的具体分子路径，例如δ珠蛋白与β珠蛋白基因的配对频率、修复酶在其中的作用等。同时，开发能降低双链断裂风险的技术（如单碱基编辑器），或成为提升CRISPR安全性的重要方向。

CRISPR的“革命”仍在继续，但这场革命的底色，或许需要更多对“意外”的敬畏与探索。毕竟，在基因编辑的世界里，精准与安全，始终是并行的生命线。

参考文献：Tharp O, Sansbury BM, Kmiec EB. CRISPR-directed gene-editing induces genetic rearrangement within the human globin gene locus. Gene. 2024;931:148879.