一种基于免疫聚焦的呼吸道合胞病毒融合蛋白单体疫苗设计策略

呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）属肺炎病毒科正肺病毒属，其感染会导致黏液分泌增加、发炎、气道变窄，是引起婴幼儿、老年人下呼吸道感染的重要病原体。RSV融合蛋白（Fusion，F）存在两种构象，在介导膜融合过程中，由融合前状态（PreF）转换为融合后状态（PostF）。RSV F蛋白表面存在至少7个抗原表位，其中针对表位Ø和表位V的抗体具有强中和活性，但仅存在于PreF蛋白构象上，提示PreF蛋白可诱导产生强中和抗体，是疫苗开发的主要靶蛋白。2023年以来，GSK、Pfizer和Moderna等公司基于PreF蛋白开发的RSV疫苗陆续获批上市。目前，RSV重组蛋白疫苗的发展主要集中在蛋白三聚体免疫原的设计和PreF蛋白构象的稳定上。前期基于结构生物学发现多种蛋白位点改造策略，如非天然二硫键的添加、空腔疏水填充突变、脯氨酸突变、静电相互作用突变、异源三聚体化结构域添加等，可将F蛋白稳定在融合前构象。然而，外源性三聚体基序的引入，可能会产生与RSV保护无关的免疫反应，因此探索基于免疫聚焦设计的RSV F蛋白单体的免疫原性和保护性具有重要意义。

近日，中国医学科学院医学生物学研究所王佑春、李倩倩团队在《Molecular Therapy》杂志上在线发表题为“Immunofocusing design of a fusion glycoprotein monomer vaccine for respiratory syncytial virus”的研究论文。该研究探索了一种基于免疫聚焦策略的RSV融合前蛋白（PreF）单体的抗原设计，称为Q74截短单体（Q74 truncated monomer）。通过对该蛋白的抗原性、稳定性、免疫原性和保护效力的评估，验证其作为候选免疫原的可能性，为RSV疫苗提供新的设计策略。

RSV PreF结构可分为3个区域，其中“头部”区域，包括抗原表位Ø；“颈部”区域，包括表位II和表位V；“茎部”区域，包括表位IV和表位I。该团队设计了一种RSV F蛋白——Q74截短单体，不引入外源三聚体基序，仅保留F蛋白的“头部”区域和“颈部”区域，由F2蛋白的26-105aa和F1蛋白的147-336aa通过GGSGGSGGS连接，并引入该团队先前发现的T72C-V76C二硫键突变和K87L空腔填充突变以稳定PreF构象。

在抗原性测定方面，使用ELISA方法检测Q74截短单体和表位特异性单抗的结合能力，结果显示Q74截短单体与PreF构象特异性表位Ø单抗D25和AM22存在浓度依赖性结合，与非构象型表位II单抗palivizumab和motavizumab存在浓度依赖性结合，不与PostF构象特异性表位I单抗4D7结合，不与“颈部”区域表位IV单抗101F结合，表明Q74截短单体维持在PreF构象上，且实现了免疫聚焦。

在稳定性测试方面，使用ELISA方法检测Q74截短单体在高温条件、极端pH条件和反复冻融条件下的构象改变，结果显示Q74截短单体具有更好的物理稳定性。在高温条件、极端pH条件下，其与对照免疫原DS-Cav1的稳定性无显著差异；而在3次和5次冻融循环后，Q74截短单体稳定性更优，其处理后构象几乎无变化，而DS-Cav1的构象几乎丧失。进一步，使用nanoDSF测定蛋白的Tm值，其中Q74截短单体的起始温度为62.0℃，Tm为66.3℃，而DS-Cav1的起始温度为27.1℃，Tm1为63.5℃，Tm2为77.9℃。因此，与DS-Cav1相比，Q74截短单体的起始温度和Tm值更高，表明在正常储存条件下具有更高的稳定性。

在免疫原性评估方面，分别检测Q74截短单体免疫小鼠后，诱导的中和抗体、结合抗体和细胞免疫强度。结果表明，Q74截短单体诱导的针对PreF蛋白的结合抗体和DS-Cav1相当，而其诱导的针对PostF蛋白的结合抗体要远远弱于DS-Cav1，表明Q74截短单体诱导的免疫反应实现了免疫聚焦。进一步利用生物层干涉法（BLI）的竞争结合试验，发现Q74截短单体免疫血清可阻断表位Ø单抗D25、AM22以及表位II单抗palivizumab、motavizumab与抗原的结合，而不阻断表位IV单抗101F与抗原的结合，表明Q74截短单体的免疫反应聚焦于抗原表位Ø和II。此外，Q74截短单体可诱导出针对RSV A2毒株和18537毒株的广谱中和活性，以及较强的细胞免疫反应。

在保护效力方面，分别使用RSV A2毒株和18537毒株感染免疫小鼠，评价病毒感染后肺组织的病毒载量和组织病理。结果表明，Q74截短单体蛋白免疫后，小鼠的肺组织病毒载量降低，肺部病理变化较轻，能够提供一定的保护效果。

综上所述，该研究开发了一种RSV F蛋白截短单体设计，实现了免疫聚焦功能，可诱导较好的免疫原性和免疫保护，且易于生产、纯化和储存，为RSV疫苗设计提供了新策略。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001625005763