JBC｜金葡菌分泌物 Staphopain A 介导炎症小体独立型 IL1β 活化

 摘要 

Interleukin-1β (IL-1β) is a pivotal mediator of innate immunity, essential for orchestrating the acute inflammatory response. While the canonical activation of IL-1β involves cleavage of its inactive precursor (pro-IL-1β) by the inflammatory cysteine protease caspase-1, certain bacterial proteases, such as those secreted by group A Streptococcus and Pseudomonas aeruginosa, can also activate pro-IL-1β. In this study, we demonstrate that infection of human N/TERT-1 immortalized keratinocytes by Staphylococcus aureus induces IL-1β processing independently of the classical inflammasome pathways. Biochemical analysis reveals that a secreted factor from S. aureus cleaves pro-IL-1β at a site proximal to the canonical caspase-1 cleavage site, rendering the cytokine bioactive. Specifically, we identify the secreted cysteine protease staphopain A as responsible for this cleavage. Our findings highlight a novel mechanism of inflammasome-independent IL-1β activation through microbial proteases, expanding the understanding of pathogen-host interactions in immune responses, specifically in the skin.

白细胞介素-1β（IL-1β）是先天免疫系统中的关键介质，对协调急性炎症反应至关重要。IL-1β的经典激活途径涉及其不活性前体（前体IL-1β）被炎症性半胱天冬酶-1（caspase-1）裂解。然而，某些细菌蛋白酶，如A组链球菌和铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶，也能激活前体IL-1β。本研究首次证实，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染人N/TERT-1永生化角质细胞可独立于经典炎症小体通路诱导IL-1β加工。生化分析显示，金黄色葡萄球菌分泌的因子在经典caspase-1裂解位点附近裂解pro-IL-1β，使其获得生物活性。具体而言，我们鉴定出分泌型半胱天冬酶 staphopain A 是该裂解的责任因子。我们的发现揭示了微生物蛋白酶介导的炎症小体独立型 IL-1β 活化的新机制，拓展了对免疫应答中病原体-宿主相互作用的理解，尤其在皮肤领域。

 实验结果1 

金黄色葡萄球菌感染导致pro-IL-1β的加工，这一过程独立于经典炎症小体通路

最近的研究表明，除了经典的免疫细胞（如巨噬细胞）外，非免疫细胞（如角质形成细胞）也表达先天免疫传感器，特别是炎症小体，并参与免疫应答。为了研究S. aureus在人类角质形成细胞中的感染，作者使用了人类N/TERT-1永生化角质形成细胞作为模型系统，因为角质形成细胞是表皮中占主导地位的细胞类型。用DPP8/9抑制剂Val-boroPro（VbP）或核毒性应激反应诱导剂Anisomycin（ANS）处理人N/TERT-1永生化角质细胞，均激活了NLRP1炎症小体，并导致IL-1β的分泌，这通过IL-1β ELISA测定（图1A）。将人类角质形成细胞感染S. aureus Rosenbach菌株后，在不同感染倍数（MOI）下均观察到IL-1β释放（图1A）。相反，角质形成细胞暴露于热灭活的S. aureus后未观察到显著的IL-1β释放，表明活的S. aureus是炎症小体活化的必要条件（图1B）。值得注意的是，S. aureus培养上清液（SN）同样能诱导IL-1β释放（图1C），表明S. aureus释放到培养基中的可溶性因子可触发炎症小体活化，即使在缺乏活菌的情况下亦然。值得注意的是，稀释上清液导致活性降低的程度超过了单纯稀释所预期，这可能由于培养基中存在一种通常被S. aureus代谢的抑制因子。除了IL-1β释放外，角质形成细胞感染S. aureus并用S. aureus上清液刺激后，还诱导了IL-18的分泌（图1D）。然而，用S. aureus刺激角质形成细胞并未诱导经典的炎症小体激活标志物，如刺激后细胞上清液中未检测到裂解的caspase-1（图1E）。此外，尽管检测到裂解的IL-1β，但其裂解模式呈现两条带，且分子量明显高于caspase-1裂解的IL-1β。为确定前体IL-1β的裂解是否可独立于炎症小体组分（如炎症小体传感器NLRP1、适配蛋白ASC或caspase-1）发生，作者感染了缺乏这些组分的角质形成细胞。结果显示，免疫印迹和ELISA仍检测到IL-1β释放（图1F和1G）。这表明存在一种S. aureus分泌因子，该因子可通过两种机制诱导IL-1β释放：一是通过宿主依赖性方式在与经典caspase-1裂解位点不同的独特位点裂解前体IL-1β；二是直接裂解前体IL-1β。

实验结果2 

Pro-IL-1β被金黄色葡萄球菌分泌的因子裂解，并具有生物活性

 IL-1β裂解的一种可能机制可能涉及S. aureus分泌的蛋白酶。为了验证这一假设，作者将重组前体IL-1β与S. aureus SN共同孵育，并通过免疫印迹法评估其加工情况。与S. aureus SN共同孵育的前体IL-1β显示出一个分子量小于25 kDa的IL-1β条带，表明发生了裂解事件（图2A）。为了评估该蛋白是否具有生物活性并能通过其特异性受体介导信号传导，作者用未经处理的 pro-IL-1β 或用 S. aureus 上清液（SN）预处理的 pro-IL-1β 处理 MeWo 成纤维细胞，并测量 IL-6 分泌量作为 IL-1 信号传导的指标（图 2B）。这些实验表明，仅有经S. aureus SN处理的促IL-1β，而非未处理的促IL-1β或S. aureus SN单独处理，在诱导IL-6产生方面具有生物活性（图2B，右侧面板）。与 pro-IL-1β 被 S. aureus SN 加工一致，这些上清液中检测到的成熟型 IL-1β 与 IL-6 反应呈良好相关性（图 2B，左侧面板）。为鉴定负责IL-1β裂解的分泌因子，作者对浓缩的S. aureus上清液进行了尺寸排阻色谱（SEC）（图2C）。通过免疫印迹分析收集的各分馏物对前体IL-1β的裂解能力，发现多个分馏物均具有裂解活性，其中分馏物6至10特异性产生了先前描述的IL-1β亚型（图2D）。通过ELISA进一步证实了这些分馏中IL-1β的成熟过程，以分馏#9为例（图2E）。当检测该分馏对前体IL-1β成熟的生物活性时，作者再次观察到MeWo细胞中IL-6分泌的强烈诱导（图2F）。值得注意的是，分馏物5和11至15也产生了差异性裂解的IL-1β产物，暗示S. aureus SN中存在额外的蛋白酶，可在不同位点裂解前体IL-1β（图2D）。

    作者在研究过程中观察到，用培养S. aureus的培养基培养的角质形成细胞在不同浓度的VbP刺激后，IL-1β信号较低。S. aureus培养基中缺失的成分包括表皮生长因子（EGF）。作者推测，补充培养基中的EGF是否能增强炎症小体激活或IL-1β分泌。确实，仅用重组EGF补充S. aureus培养基后，炎症小体激活后IL-1β的分泌水平恢复至与角质形成细胞常规培养基中观察到的水平相当。作者进一步探究了EGF对炎性小体组分的影響，并检测了NLRP1及前体IL-1β的表达。结果显示，缺乏EGF的培养基中前体IL-1β及裂解型IL-1β水平均显著降低，但补充重组EGF后恢复至正常水平。这凸显了EGF在调节角质形成细胞中炎症小体激活和IL-1β分泌中的关键作用。

实验结果3 

半胱氨酸蛋白酶的鉴定及其对pro-IL-1β的切割位点

接下来，作者旨在确定S. aureus上清液处理后前体IL-1β（pro-IL-1β）的具体裂解位点。为此，作者将未经处理的pro-IL-1β与体外裂解的pro-IL-1β均进行质谱分析（MS）。这使作者能够精确定位裂解位点，结果显示前体IL-1β在氨基酸111位点后发生裂解，产生一个由158个氨基酸组成的活性片段（图3A）。该位点位于caspase-1的共识裂解位点附近，后者在氨基酸116和117之间进行裂解。为验证该裂解位点，作者构建了两个前体IL-1β突变体，分别在P2、P1和P1’位点引入点突变（pro-IL-1βN110K, E111P, A112N和pro-IL-1βN110K, E111H, A112N）。重组前体IL-1βN110K, E111P, A112N和前体IL-1βN110K, E111H, A112N仍被S. aureus SN裂解，但主要裂解产物与未修饰的 pro-IL-1β 相比分子量更大，表明裂解发生在靠近 N 端的不同位点。为了鉴定负责裂解前体IL-1β的S. aureus分泌型蛋白酶的类别，作者测试了多种蛋白酶抑制剂，以评估其阻断S. aureus上清液介导的裂解的能力。作者使用了cOmplete混合抑制剂（抑制丝氨酸、半胱氨酸和金属蛋白酶），以及丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64（图3B）。有趣的是，cOmplete和E-64均抑制了前体IL-1β的裂解，免疫印迹分析证实了这一点，表明金黄色葡萄球菌中存在一种类似于caspase-1的半胱氨酸蛋白酶，是该裂解反应的执行者。

为了鉴定S. aureus中负责裂解前体IL-1β的蛋白酶，作者采用了活性基探针DCG-04，即E-64的生物素标记版本。与E-64类似，DCG-04可与半胱氨酸蛋白酶共价结合并不可逆地抑制其活性，因此非常适合免疫沉淀（IP）研究。作者将S. aureus上清液的活性SEC分馏池混合后，部分样本未经处理，部分样本预先与E-64孵育以阻断半胱氨酸蛋白酶的活性位点（图3C）。随后使用DCG-04进行免疫沉淀（IP）（图3D）。仅在未处理的样本中检测到与半胱氨酸蛋白酶对应的条带，随后通过质谱分析确认了两种半胱氨酸蛋白酶：staphopain A 和 staphopain B。

实验结果4 

半胱氨酸蛋白酶 Staphopain A 裂解 pro-IL-1β

尽管作者已鉴定出S. aureus中分泌的半胱天冬酶A（staphopain A）和半胱天冬酶B（staphopain B），但尚不清楚其中哪一种或两种均能裂解前IL-1β（pro-IL-1β）。为明确这一点，作者使用了S. aureus的USA300菌株及其针对每种半胱天冬酶的基因敲除突变株。在体外裂解实验中，作者使用重组前体IL-1β与金黄色葡萄球菌Rosenbach菌株和USA300菌株的上清液孵育后，观察到前体IL-1β被裂解（图4A）。值得注意的是，Rosenbach菌株产生了一条主要的裂解条带，而USA300菌株产生了多条条带，表明蛋白酶的表达具有菌株特异性。值得注意的是，与 IL-1β 类似的主要裂解产物在 staphopain A 缺失突变体（ΔscpA）中缺失，但在 staphopain B 缺失突变体（ΔsspB）中仍存在。双缺失突变体（ΔscpA/ΔsspB）未显示裂解活性，证实 staphopain A 而非 staphopain B 专门裂解 pro-IL-1β。

    为验证staphopain A介导的裂解的生理学意义，作者将S. aureus Rosenbach、USA300野生型及其对应缺失突变株的上清液转移至MeWo细胞，此前已用前体IL-1β预孵育。上清液单独作为对照。与 pro-IL-1β 孵育的 Rosenbach 和 USA300 野生型菌株的上清液均诱导 IL-6 分泌，而用 staphopain A（ΔscpA）和双突变体（ΔscpA/ΔsspB）菌株上清液处理的 pro-IL-1β 则未诱导 IL-6 分泌（图 4B）。测得的IL-6水平与上清液中检测到的成熟IL-1β的存在呈正相关。这些结果表明，staphopain A特异性裂解前体IL-1β，将其转化为具有生物活性的形式。

实验结果5 

金黄色葡萄球菌 α-毒素介导角质形成细胞的细胞死亡

虽然作者已证实staphopain A可裂解前IL-1β，但该蛋白酶如何获得其底物访问权限的机制仍不清楚。作者考虑的一种可能解释是，staphopain A可能通过裂解GSDMD或GSDME等gasdermins触发凋亡，类似于A组链球菌蛋白酶SpeB诱导凋亡的机制。N/TERT-1角质形成细胞的RNA测序数据表明，GSDMA和GSDMB的表达量极低，GSDMC表达中等，而GSDMD和GSDME的表达量均很高。这些发现提示，staphopain A可能通过裂解一种或多种gasdermins，引发凋亡并随后释放前IL-1β。为验证这一假设，作者建立了分别敲除GSDMC、GSDMD或GSDME（基因名DFNA5）的角质形成细胞系，并用活S. aureus或S. aureus上清液处理（图5A）。然而，尽管ANS以GSDMD依赖性方式诱导细胞死亡，但靶向的任何气体德明均未参与S. aureus诱导的细胞死亡（图5A）。

    另一种可能的机制涉及S. aureus α毒素，该毒素已被证实可在宿主细胞膜上形成孔道。这种孔道形成可能导致细胞肿胀并最终破裂。为验证这一假设，作者使用了USA300菌株及其α毒素缺失突变体（Δhla）。此外，作者还纳入了sae调控突变株（Δsae），该突变株缺乏大部分分泌毒素和外酶，以及agr群体感应突变株（Δagr），其中所有毒素和蛋白酶的产生均被抑制。由于所有突变株均源自USA300背景，作者首先评估了USA300和S. aureus Rosenbach菌株诱导的细胞死亡水平是否相当。7小时后，不同MOI感染及USA300上清液刺激后，细胞死亡程度低于Rosenbach菌株（图5B, C）。然而，至24小时，细胞死亡水平趋于一致，表明USA300对角质形成细胞的细胞毒性作用较Rosenbach菌株存在延迟。

    为验证α毒素及调控通路的作用，作者评估了上述USA300衍生突变株。如预期，Δhla和Δsae菌株的上清液仍能裂解重组前IL-1β，而Δagr上清液则无裂解活性（图5D）。此外，用staphopain A和B缺失突变株的上清刺激角质形成细胞，导致细胞死亡程度与野生型USA300菌株相当，表明这些蛋白酶并非细胞死亡诱导所必需（图5E）。值得注意的是，用Δhla、Δsae和Δagr突变株的上清液处理的细胞中细胞死亡完全被抑制，表明α毒素在介导细胞毒性中起关键作用（图5E）。与之一致，用α-毒素缺失菌株感染角质形成细胞后，裂解的IL-1β水平显著低于野生型USA300菌株（图5F）。这些发现表明，S. aureus α-毒素驱动细胞死亡，从而释放前体IL-1β，随后被staphopain A裂解并激活。