清华大学娄智勇教授/饶子和院士合作发现冠状病毒复制模板循环与RNA加帽的协同机制

围绕一个蛋白质分子机器，机制研究能够做到多深入？近日，清华大学娄智勇教授/饶子和院士、中国医学科学院北京协和医院朱兰教授团队与广州国家实验室、南开大学等单位合作，揭示了冠状病毒转录复制过程中RNA模板循环和RNA加帽的共发生机制，重构了病毒领域对RNA病毒转录复制过程的认知。该工作于2025年10月22日在Cell在线发表。这是团队在冠状病毒转录复制机制的研究中，自2020以来在Science、Cell等期刊上连续发表10项成果后的又一重要工作。

RNA病毒是一种极其简单但高效的生命形式。在生命周期中，RNA病毒利用有限的基因组，编码几个到十几个蛋白质，即可完成高效扩增，这要求病毒基因组必须能够高效的循环使用。同时，转录形成的新生RNA 5’端带有三磷酸基团，一旦释放到宿主细胞中，会迅速激活宿主细胞的先天免疫反应，因此必须立即对其5’端的三磷酸基团进行加工，形成“帽”（Cap）结构，从而逃逸宿主天然免疫的攻击。虽然基因组的高效重复使用、RNA加帽是RNA病毒生命过程中最核心、最基础的生物学事件，但自从100多年前发现第一种RNA病毒至今，这两个过程协同发生的机制一直是病毒学领域的关键未解之谜。

围绕冠状病毒转录复制过程，研究团队在过去5年中先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）[1]、“延伸复合体”（E-RTC）[2]、“加帽中间态复合体”[3, 4]和“Cap0加帽复合体”[5]的工作机制。在这些工作的基础上，研究团队设计了多种全新核酸骨架，成功捕捉到转录复制复合体“加帽起始前状态”（Pre-Capping Initiation, Pre-CI）和“加帽起始后状态”（Post-Capping Initiation, Post-CI）两个超级复合体，阐明了RNA模板循环和RNA加帽起始过程协同发生的分子机制（图1）。

图1. 冠状病毒“模板循环”和“RNA加帽起始”共发生机制的模型

在该工作中，研究团队首先设计合成了具有39 bp配对双链的RNA骨架，利用高活性的新冠病毒解旋酶和其他转录复制酶，共同组装成“加帽起始前状态”复合体（图2）。该复合体包含四个延伸复合体（E-RTC），其中两个延伸复合体形成“背靠背”二聚体形态，再由两个二体以“头对头”的模式形成四聚体形态的超级复合体。在超级复合体中，由聚合酶nsp12催化位点延伸出来的“模板-产物”双链RNA，被处于“头对头”位置的延伸复合体中的解旋酶解开为单链，并进一步将模板RNA传递至“头对头”位置的延伸复合体中的聚合酶催化反应中心，从而实现了模板RNA的循环再利用。

图2. （a）组装加帽起始前状态复合体所使用的RNA骨架。（b）加帽起始前状态复合体的四聚体全貌。（c）加帽起始前状态复合体中“模板-产物”双链RNA的解旋。

在“加帽起始前状态”复合体中，另一关键性发现是团队首次确定了冠状病毒解旋酶3’-5’的解旋极性，明确了解旋的关键结构单元，展现了由ATP水解驱动的双链RNA解旋动态过程（图3）。在冠状病毒研究领域，自从2000年第一次确定其解旋酶以来，一直认为其解旋极性是5’-3’，但由于和许多认知相冲突，一直备受争议。这项工作利用结构生物学手段，直观、明确的表明冠状病毒解旋酶的解旋方向，终结了对这一问题的争论。

图3. 左图，新冠病毒解旋酶的关键结构单元。右图，ATP水解驱动的双链RNA解旋模式图。

随后，研究团队设计合成了具有非配对双链的RNA骨架，通过在体系中加入nsp9蛋白，捕捉到“加帽起始后状态”的复合体（图4）。加入nsp9蛋白后，复合体由加帽起始前状态的四聚体形态，转变为加帽起始后状态下的二聚体形态。最关键的一点是，RNA产物链5’端三磷酸集团，和nsp9蛋白N端氨基酸共定位于聚合酶NiRAN结构域的催化位点。在以往的研究中，一般认为冠状病毒的加帽过程由nsp13、nsp12 NiRAN结构域、nsp14、nsp16四个酶分子先后催化完成。2022年，研究团队发现了由nsp9 RNAylation介导的RNA加帽的全新机制[4]，在该机制中，nsp12 NiRAN结构域可以不依赖nsp13，独立起始RNA加帽过程，但这两种加帽机制到底哪种更接近真实生命过程还存在争论。这项成果明确表明，新生RNA产物链5’端不会释放到溶液中、并由nsp13进行初步加工，而是直接进入nsp12 NiRAN结构域，通过nsp9 RNAylaion介导的方式起始RNA加帽过程，更新了对冠状病毒加帽过程的认知。也再一次以无可辩驳的结构生物学证据证明了团队发现的NiRAN催化、以GTP为底物的RNA加帽机制，终结了围绕NiRAN加帽机制的争论。

图4. （a）组装加帽起始后状态复合体所使用的RNA骨架。（b）加帽起始后状态复合体全貌。（c）加帽起始后状态复合体中RNA产物链5’三磷酸集团与nsp9蛋白共同定位与NiRAN结构域催化中心。

该成果重构了对病毒转录复制过程的认识体系，结束了对冠状病毒解旋酶极性、加帽机制等问题长达25年的争论。成果的获得得益于研究团队在冠状病毒转录复制领域中20余年的长期积累。自2020年以来，研究团队系统研究了新冠病毒转录复制过程，阐明了转录复制复合体多个状态三维结构，为认识病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，还对新冠病毒对女性生殖道感染，以及新冠病毒灭活疫苗接种对母胎影响方面进行了深入研究，先后在Science（1）[1]、Cell上（6）[3-7]、Nature Communications（1）[2]和JACS（1）[8]、STTT（1）[9]和Clin Infect Dis（1）[10]上发表系列研究论文，是国际上新冠病毒转录复制研究中最为系统、引用最多的工作之一，成果入选 “中国科学十大进展”、“中国生命科学领域十大进展”、“中国2021年度医学重要进展”、“中华医学科技奖”等。