Sci Immunol丨谢振飞等报道mRNA-LNP免疫原同时激活识别HIV包膜蛋白不同表位的前体B细胞

人类与人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）抗争了近半个世纪，至今尚没有一款有效的HIV疫苗问世。广谱性中和抗体（broadly neutralization antibodies，bNAbs）是一类能特异性识别病毒，并且能阻断病毒复制、扩增或者传播的抗体，由一群特殊的白细胞—B淋巴细胞产生，也是众多疫苗接种后能够发挥其功效的主要效应物。在HIV慢性感染的病人中，分离出的bNAbs主要靶向HIV 包膜（Envelope，ENV）蛋白的几个保守的表位（epitope），然而这些诱导产生的bNAbs大多都是病人体内的前体B细胞和HIV长期共同进化的结果。

相比较严重的呼吸道冠状病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV2)，HIV病毒的ENV蛋白包含了丰富复杂的多糖（glycan）修饰，导致能诱导中和抗体表位的免疫原性低，并且HIV有更多的变异株，更强的遗传物质突变率和免疫逃逸能力，给疫苗研发带来了巨大的挑战。先前的bNAb鸡尾酒疗法能够长时程抑制HIV病毒血症的研究结果表明，如果疫苗能诱导出bNAb同时识别HIV ENV抗原不同的中和表位，那么这个疫苗可能会十分有效。

2025年10月17日，Science Immunology以长文的形式在线发表了题为Simultaneous priming of HIV broadly neutralizing antibody precursors to multiple epitopes by germline-targeting mRNA-LNP immunogens in mouse models 的研究，报道了mRNA-LNP免疫原同时激活识别HIV包膜蛋白不同表位的前体B细胞。

研究中使用了多个靶向HIV bNAb前体B细胞人源化的小鼠模型，这些模型通过CRIPSR-Cas9技术将表达人的抗HIV bNAb的前体B细胞受体（B Cell Receptor，BCR）DNA序列敲入到小鼠的BCR基因编码区，使其“人源化”。这种“人源化”小鼠B细胞能够提呈人的BCR到细胞膜表面，能够更好的被用于评估疫苗后续在人类临床上的有效性。此外该研究中使用到了多个针对不同抗原表位设计的种系靶向激活（Germline Targeting，GT）的蛋白质和mRNA-LNP免疫原用来系统性测试疫苗和前体细胞共同激活的特性。

在这篇文章中，研究人员首先利用识别V3-glycan (BG18Hgl) 和V2-apex (PCT64LMCA) 的前体B细胞（C57BL/6J 背景, CD45.2+），通过静脉注射移植到同类系（congenic）的小鼠（CD45.1+）上，稀释这群前体细胞，以模拟其在人体内的生理低频率特性，通过抗CD45.2 和抗CD45.1的流式抗体染色，即可以追踪对疫苗产生响应的细胞；随后研究人员给受体小鼠接种GT三体蛋白免疫原混合物——N332-GT5和ApexGT5。免疫后，大量的CD45.2+前体B细胞被招募到生发中心（Germinal Center, GC），提示这些前体细胞发生了特异性的激活；然而这些CD45.2+前体细胞几乎只识别N332-GT5的荧光探针，而对ApexGT5的探针鲜有结合，提示只有BG18Hgl的前体细胞被有效活化，而接下来的单细胞BCR测序进一步验证了这个结果。在免疫反应的第28天，大量的BG18Hgl重链（Heavy Chain，HC）和有限的PCT64LMCAHC在抗原决定簇（Complementarity-Determining Regions，CDRs）发生了体细胞高频突变（Somatic Hypermutation，SHM）。

之前研究表明bNAb前体B细胞在整个B细胞库的分布频率会影响其对免疫原的反应效果。为了探究能否通过提高V2-apex前体B细胞的频率改善其在共同激活条件下的表现，研究人员这次构建了两组实验组BG18High（BG18Hgl细胞移植数量提高10倍，10X；PCT64LMCA移植数量不变，1X）和PCT64High（BG18Hgl细胞移植数量不变，1X；PCT64LMCA移植数量提高10倍，10X），随后给小鼠接种GT免疫三体蛋白免疫原混合物——N332-GT5和ApexGT5。在PCT64High组，增加V2-apex前体B细胞的频率10倍能够一定程度上增强其对混合蛋白疫苗的响应，但是效果依旧欠佳。已有研究表明通过mRNA-LNP编码膜锚定的ApexGT5三体蛋白免疫原能够降低激活V2-apex前体B细胞的门槛，为了验证mRNA-LNP免疫原在同时激活多个前体细胞的条件下是否仍然更加有效，研究人员在移植了BG18Hgl和PCT64LMCA细胞后（细胞频率均为1X），给受体小鼠接种单个N332-GT5，或者单个ApexGT5或者同时这两个mRNA-LNP的混合物，这些mRNA都编码膜锚定的三体蛋白。免疫小鼠后，研究人员只在同时接种mRNA免疫原混合物组观察到了大量CD45.2+前体B细胞进入GC，并结合了N332-GT5或者ApexGT5的荧光探针，这提示V3-glycan和V2-apex前体B细胞能够被mRNA免疫原同时高效活化；与单个mRNA免疫原接种组相比，接种两个mRNA免疫原同时活化了两种不同的前体B细胞谱系，而且不会抑制他们各自的激活强度和后续的突变成熟过程。为了进一步探究在mRNA疫苗接种下，前体B细胞频率如何影响多个前体B细胞的同时活化的过程，研究人员再次构建了BG18High和PCT64High的实验组，然后给受体鼠同时接种N332-GT5和ApexGT5 mRNA免疫原。实验结果显示在该条件下，提高BG18Hgl或者PCT64LMCA前体细胞频率多达10倍也几乎不影响这两个谱系各自的活化强度和突变成熟状态，而这可能与前体B细胞分化为浆细胞后分泌的血浆抗体反馈调节B细胞反应的过程相关。

接下来，研究人员同时移植了CD45.2+ V2-apex（PCT64LMCA）和CD4bs（CLK09）前体B细胞，随后给受体鼠接种了ApexGT5三体蛋白和eOD-GT8 60聚体蛋白免疫原，在这种情况下，CD45.2+前体细胞主要识别eOD-GT8荧光探针，然而识别ApexGT5荧光探针的十分稀少，说明识别CD4bs前体B细胞被有效活化，然而识别V2-apex前体B细胞响应仍旧微弱。紧接着研究人员在移植这两种细胞后，给小鼠接种了ApexGT5 mRNA-LNP （编码膜锚定三体蛋白）和eOD-GT8 mRNA-LNP（编码分泌型60聚体蛋白）混合物，与此前类似，V2-apex和CD4bs前体B细胞能够同时被mRNA免疫原有效激活。

为了进一步探究V3-glycan，V2-apex和CD4bs三种前体B细胞能否被同时激活，研究人员在移植CD45.2+ V3-glycan前体（BG18Hgl）、V2-apex前体（PCT64LMCA）和CD4bs前体（CLK09）细胞后，给受体小鼠同时接种了低、中和高三种不同剂量N332-GT5三体、ApexGT三体以及eOD-GT8 60聚体mRNA-LNP免疫原混合物。结果显示在不同剂量组中，大量CD45.2+前体B细胞均能够进入GC，它们都能结合N332-GT5、ApexGT5和eOD-GT8三种不同的荧光探针，并且这种激活几乎不受mRNA接种剂量的影响；此外三种不同谱系的前体细胞在同时激活后能够分化出浆细胞分泌表位特异性的IgG抗体，而且前体B细胞能够进行高效的SHM，其重链CDRs突变谱与单个抗原激活单一前体B细胞谱系类似。

最后研究人员在此基础上，又引入了识别MPER表位的前体B细胞MPER-HuGL18H和对应的GT免疫原10E8-GT12 24聚体mRNA-LNP，以尝试同时激活四中不同的HIV bNAb前体B细胞。结果显示，在注射四种mRNA-LNP免疫原混合物后，大量在GC扩增的CD45.2+前体细胞能同时识别N332-GT5, ApexGT5, eOD-GT8和10E8-GT12荧光探针，并诱导血浆抗原表位特异性的IgG抗体反应和B细胞SHM和成熟。

这篇研究进一步为GT 和递进式免疫策略在HIV疫苗开发上的可行性和有效性提供了证据，同时文章发现基于mRNA-LNP平台对免疫原进行包装能让不同前体B细胞谱系的激活更加平衡和高效，为HIV多价疫苗的开发奠定了基础，提供了一个潜在可行的疫苗研发策略。此外同期另一篇背靠背文章表明N332-GT5三体、Apex-GT6三体和10E8-GT12 24聚体蛋白免疫原混合物通过特定的佐剂包被和接种流程递送，在恒河猴（rhesus macaques）中能同时高效激活识别V3-glycan、V2-apex和MPER表位的bNAb前体B细胞，为疫苗迈入临床测试提供了另一个有利的证据。

最后艺术家协助设计了一幅插画来表达这项研究所揭示的主要信息，插画的主题为“琼浆玉液酿百花”。画面中，一辆洒水车沿着蜿蜒的山路缓慢行进，向道路两旁喷洒mRNA-LNP的免疫原混合物液滴。泥土之下，不同种类的bNAb前体B细胞如种子般破土而出，一些已经发芽，一些刚形成花骨朵，另有一些则含苞待放，显露出抗体形态的花蕊。然而前方道路依旧漫长，预示成型的疫苗研发尚处在早期阶段。

原文链接：

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciimmunol.adu7961