提升化学消毒剂病毒杀灭活性测试有效性：新参考物质的建立

在欧洲范围内，化学消毒剂的病毒灭活效力测试通常遵循分级方法，对包膜病毒与非包膜病毒都要覆盖相应的替代测试对象。EN 14476:2019 作为关键标准，规定了用于定量悬浮测试的参考物质。在多年的实践中，正式被选作参考物质的是甲醛，其优点在于广谱活性、稳定性以及与现有测试框架的良好兼容性。然而，甲醛的毒理学风险引发广泛关注：具有致癌潜在、慢性暴露风险及较慢的动力学特征，使其在日常消毒测试中的长期使用受到质疑与限制。因此，找到更安全、同样适用的参考物质成为提升病毒灭活测试有效性与可比性的关键。

因此，在 2023–2024 年间欧洲标准化委员会组织了一项国际环试验，旨在通过17家实验室的协作，评估并确立新的参考物质，以取代甲醛。其核心目标是评估两种潜在替代参考物质：戊二醛（glutaraldehyde，GDA）和过氧乙酸（peracetic acid，PAA）。

一.研究设计

涵盖包膜病毒与非包膜病毒的6种病毒

1. 改良痘苗病毒安卡拉株（MVA）

2. 腺病毒5型（AV5）

3. 鼠诺如病毒（MNV）

4. 鼠细小病毒（MVM）

5. 脊髓灰质炎病毒1型（PV-1）

6.牛肠病毒1型（ECBO）

参照 EN 14476:2019 的测试框架，使用 PBS 作为干扰物，温度分别设定为 GDA 的 20°C、PAA 的 10°C，以模拟不同条件下的测试场景，并且对参考物质在测试开始时和各接触时间点的稳定性进行监控。

二、结果定性与定量标准

一个关键产出是为每种病毒在特定参考物质下给出lg下降范围（通常为 ±1 lg 的区间，以确保在多实验室条件下的稳定性与可比性）。

对 ECBO而言，GDA 在多种浓度–时间关系下并未表现出随浓度增加而增强的动力学趋势，因此未能用 GDA 定义可用的参考范围；因此选择 PAA 做为 ECBO 的替代参考物质，并采用双区间设计以覆盖其快速动力学特征。

对其他病毒，GDA 在多代实验中（如 MVA、MNV、MVM、PV-1）给出了稳定且可重复的 lg下降范围；AV5 的数据则因为跨细胞系的显著变异而需要额外的研究来界定可用区间，最终聚焦在使用 HeLa细胞时的结果，以确保统计的稳健性。

评价结果

1.新的可替代参考物质及其适用性

GDA 与 PAA 两者均通过了环试验的多实验室评估，在大多数病毒—参考物质组合下，能够提供可重复、可再现的 lg下降范围，且符合 EN 14476 及后续更新的统计及质量要求。

GDA 的优势在于广谱活性、材料相容性与成熟的测试经验；PAA 的优势则在于广谱活性、在某些场景中的更快动力学。两者的组合为未来正式替代甲醛提供了现实路径。

2.为不同病毒定义了具体的 lg下降范围

MVA 与 GDA：在 50 ppm、5–50 min 条件下得到最具可重复性的数据集，排除个别异常样本后，平均 lg下降约为 1.40 ± 0.23。

AV5 与 GDA：存在较高的变异性，导致难以在总样本层面定义统一的范围；但在限定为使用 HeLa 及其衍生细胞系、且在 50 ppm、30 min条件下，结果趋于稳定，成为参考数据的核心组成部分。

MNV 与 GDA：在 100 ppm、30 min 条件下获得高度稳定的结果，排除少数异常样本后，平均 lg下降约为 2.09 ± 0.15。

MVM 与 GDA：在 500 ppm、30 min 条件下基础数据稳定，纳入lg下降范围的判断。

PV-1 与 GDA：同样在 500 ppm、30 min 条件下获得稳定结果，成为 GDA 的另一落点。

ECBO 与 PAA：由于 GDA 对 ECBO 不具备明显的提升动力学（未观察到随浓度升高的更大 lg 减少），因此 ECBO 的替代方案选用 PAA，并在 25 ppm 与 100 ppm 两种浓度下分别设计了两组测试路径，得到两个可定义的lg下降区间。

3.结果纳入正式标准更新

研究结果直接推动了EN 14476:2024以及 EN 17914:2024 的编制，使得新确定的参考物质及其 lg下降范围成为未来全球实验室进行病毒杀灭活性测试时的正式参照。

这意味着逐步摆脱甲醛作为唯一参考物质的局限，提升测试的安全性与可操作性，并进一步提高结果的跨实验室可比性。

对标准化与实验室实践的影响

1.提升测试结果的可比性与质量控制

引入 GDA 与 PAA 作为参考物质，并据此建立具体病毒的 lg下降范围，使得各实验室在进行病毒杀灭测试时，能以共识的内部对照来校验病毒稳定性与试验过程的完整性。

通过对重复性与再现性设定明确阈值（如重复性 ≤0.5、再现性 ≤1.0（大多数情形），AV5 例外）以及对每个病毒在特定条件下的 lg下降平均值进行 ±1 lg的界定，强化了实验室间的对比性。

2.实操层面的新设计要点

对 ECBO 的 PAA 双区间设计，体现了对极端动力学特征的适应。环试验不仅要找到能达到 4 lg 减少的区间，更要确保在不同浓度–时间组合下，病毒的可检测性与测试的稳定性并存。

AV5 的问题体现了病毒-细胞系组合对结果的影响，强调未来在标准中对细胞系的规定或推荐可能需要进一步细化，以减少跨实验室变异。

参考资料：

Roesch KM, Hildebrandt C, Eggers M, Brill F, Cavalleri M, Gebel J, Hunsinger B, Loeffert S, Rausch M, Schwebke I, Steinhauer K, Exner M, Mutters NT. Enhancing the validity of virucidal activity testing of chemical disinfectants by establishing new reference substances according to EN 14476:2019. GMS Hyg Infect Control. 2025, 9;20:Doc50. doi: 10.3205/dgkh000579