突破传统诊断瓶颈！可穿戴 CRISPR 微针实现 1 小时内无扩增检测皮肤感染细菌

皮肤感染的快速、无创且原位检测是临床诊断中一项关键的未满足需求，金黄色葡萄球菌等病原体常引发手术部位和软组织感染，而传统诊断方法存在处理时间长、设备要求复杂、在复杂生物基质中灵敏度低等局限，难以满足即时临床决策需求，且耐抗生素金黄色葡萄球菌（S. aureus）的威胁进一步凸显了早期精准检测病原体的重要性。

现有可穿戴生物传感技术多聚焦于 pH 变化等间接生物标志物，无法直接检测病原体，要实现对间质液中细菌 DNA 的直接、实时识别且无需侵入性采样或核酸扩增仍面临重大技术挑战，而 CRISPR/Cas12a 系统具有高特异性和附带切割活性，微针技术能微创获取间质液，将二者整合为用于原位细菌 DNA 检测的可穿戴、无扩增系统，成为解决上述问题的潜在方案，相关研究也尚未有针对间质液中细菌 DNA 的成熟系统，因此亟需开发相关平台以推进床旁诊断发展。

该研究^[1]围绕 CRISPR/Cas12a 功能化 微针（MN）生物传感器的开发与验证展开，采用多维度实验方法并通过系列图表呈现结果：

1、传感器制备与表征：以聚苯乙烯（PS）为基底制备微针，依次修饰金（Au）层、氧化石墨烯 - 壳聚糖（GO-CS）复合物，再通过化学活化固定 CRISPR/Cas12a 组件（Cas12a、crRNA、铁氰化标记 ssDNA）。结果显示微针形态均一，GO 修饰后呈致密片状结构（SEM），元素分析显示 C/O 含量升高、Au 含量降低（EDS），荧光与电化学检测证实 CRISPR 组件有效固定（图1）。

2、CRISPR/Cas12a 系统功能验证：通过荧光实验检测反式切割活性，琼脂糖凝胶电泳验证顺式切割活性。仅完整系统（含靶标 DNA、Cas12a、crRNA）呈时间依赖性荧光增强，靶标 dsDNA 被有效降解（图1G-H）。

图1 CRISPR 组件固定验证

3、生物相容性与微创性评估：HEK293 细胞与微针共孵育后做活 / 死染色、CCK-8 实验；小鼠背部皮肤进行微针穿透与恢复观察，结合 H&E 染色。细胞存活率高（与对照组无差异，p>0.05），微针可穿透至间质液层，无明显炎症，220 分钟后微通道部分闭合（图2）。

图2 MN应用的生物相容性与组织反应

4、体外与体内检测：将微针暴露于不同浓度 S. aureus DNA，用差分脉冲伏安法（DPV）检测，同时测试非靶标菌（如沙门氏菌）特异性（体外）；小鼠皮下注射细菌 DNA，通过反向离子电渗（10V，10min）促进 DNA 向微针迁移，后续用 qPCR 和 DPV 分析（体内）。结果显示，电流信号与 DNA 浓度对数线性相关（R²=0.979），检测限 0.69 pM，仅 S. aureus DNA 产生显著信号。微针仅特异性捕获 S. aureus DNA（qPCR），DPV 在缓冲液与 PBS 中均观察到显著电流变化（图3）。

图3 CRISPR /Cas12a MNs用于体内DNA捕获和离体传感

5、原位细菌检测：将小鼠皮下注射活 S. aureus 与裂解缓冲液，30 分钟后施加微针传感器，结合电泳、荧光、培养实验及电化学检测。结果表明，裂解缓冲液有效释放细菌 DNA，传感器原位检测限达 4.27×10⁵ CFU/mL（R²=0.964），结果可无线传至手机（图4）。

图4 利用 CRISPR /Cas12a MN传感器进行细菌DNA的原位检测

 值得注意的是，当前 CRISPR/Cas12a 微针贴片需在 - 20℃下储存以维持稳定性，使用前还需复水，无法实现室温稳定保存，这极大限制了其在床旁诊断（POCT）场景中的便捷部署，尤其难以满足资源有限环境下的即时使用需求。

参考文献：

[1] Hao X, Qin C, He C, et al. In Situ Detection of Bacteria from Skin Interstitial Fluid via CRISPR Microneedles: An Amplification-Free Platform for Point-of-Care Diagnostics[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2025: 118123