病毒复制过程中的宿主因子：基于复制子的全基因组CRISPR敲除筛选方法

病毒如何利用宿主细胞机制进行RNA复制？这一问题对理解病毒生物学、宿主范围和抗病毒药物开发至关重要。传统全基因组CRISPR敲除筛选常受病毒入口阶段主导，难以专攻复制依赖因子。近日，一项研究引入病毒复制子系统，成功识别三种RNA病毒的复制特异宿主因子，为病毒学提供新工具。

2025年12月10日，在《Nature Communications》期刊在线发表题为“Replicon-based genome-wide CRISPR knockout screening for the identification of host factors involved in viral replication”的文章，该研究由美国Chan Zuckerberg Biohub的研究团队主导此项工作，并与美国国家过敏和传染病研究所合作。该团队针对登革病毒2型（DENV-2，正链RNA病毒，Flaviviridae科）、基孔肯雅病毒（CHIKV，正链RNA病毒，Togaviridae科）和埃博拉病毒（EBOV，负链RNA病毒，Filoviridae科）进行筛选，这些病毒代表不同复制策略和家族，具有显著公共卫生意义。复制子CRISPR敲除（KO）筛选在生物安全二级（BSL-2）条件下绕过病毒入口和出口，专注识别复制必需基因。该方法补充活病毒筛选的不足，并验证候选基因在活病毒感染中的作用。

传统筛选的局限：入口偏倚与下游因子缺失

病毒生命周期包括入口、翻译、复制、组装和出口。全基因组CRISPR敲除筛选通过细胞存活选择鉴定宿主因子，曾快速解析SARS-CoV-2机制。但结果常变异大，入口因子（如受体）主导，复制因子易被忽略。例如，DENV-2活病毒筛选反复识别内质网膜蛋白复合体（EMC）和寡糖转移酶（OST），但某些RNA结合蛋白（如ASCC3、RRBP1）仅在部分筛选中出现。CHIKV筛选限于入口受体MXRA8和复制因子FHL1。EBOV高致死率要求BSL-4操作，限制筛选规模。

这些局限源于病毒生物学：多受体使用、复制动力学差异等。变异方法如荧光激活细胞分选（FACS）黄热病毒筛选或嵌入gRNA的病毒基因组筛选已识别部分下游因子，但缺乏专攻复制的通用平台。复制子——去除结构基因的亚基因组RNA——保留非结构基因编码复制酶，用荧光报告子（如eGFP）替换，提供自主复制而不产生感染颗粒的系统。

方法创新：稳定复制子细胞系的构建与筛选

团队开发可扩展策略生成稳定复制子细胞系，使用Huh7.5.1-Cas9细胞，确保报告子表达均匀（>80% eGFP阳性）和对抑制敏感。以DENV-2基准：基于16681株，插入eGFP-Zeocin融合盒子，添加PEST序列缩短eGFP半衰期。Western blot确认NS2B、NS3、NS4B表达；RNA聚合酶抑制剂7-deaza-2'-C-methyladenosine（MK-0608）剂量依赖降低信号；EMC/OST敲除抑制eGFP。

筛选用Brunello gRNA文库（全基因组覆盖）转导细胞，FACS分选eGFP低群（复制受阻），高通量测序分析gRNA丰度，MAGeCK软件计算基因富集。类似扩展至CHIKV（基于LR-2006 OPY1株，优化eGFP-Zeocin）和EBOV（整合4cis系统：NP、VP35、VP30、L基因，支持负链小基因组复制）。

DENV-2筛选结果：已知复合体与新型翻译调控因子

DENV-2筛选富集已知复制必需复合体：EMC、OST、内质网相关降解（ERAD）和ER转位子。基因本体（GO）分析突出ER相关通路，与文献一致。比对先前Huh7.5.1活病毒筛选，共享核心因子，但复制子独家识别15基因，包括DOHH、PRKRA、SEL1L、SENP1、UBE2G2、ZFP36L2。其中，SEL1L曾在DENV-2插入突变筛选中出现，UBE2G2参与ERAD，在西尼罗病毒中调控蛋白稳态。

验证：单个敲除在复制子细胞减少eGFP（DOHH等6个显著）。活DENV-2感染（MOI=0.1，48 h）用荧光素酶报告病毒和RT-qPCR确认，敲除降低病毒蛋白和RNA水平（如PRKRA敲除RNA降至对照60%）。

CHIKV筛选结果：压力颗粒与高尔基体运输依赖

CHIKV复制子优化后稳定表达（>90% eGFP），敲除G3BP1（与nsP3互作）降低信号，MXRA8（入口因子）无影响。筛选富集18基因：压力颗粒（CSDE1、G3BP1/2）、高尔基运输（EPS15L1、GOLGA7、SEPTIN6）、翻译后修饰（BAG6、PCBD1、POFUT2）、转录调控（CEBPA等）和杂类。

验证CSDE1（RNA结合蛋白，调控压力颗粒）和GOLGA7（高尔基膜组件，涉运输）。活CHIKV感染（LR-2006 OPY1，MOI=0.1）RT-qPCR显示，CSDE1/GOLGA7敲除延缓RNA积累（25 h低于对照70%），G3BP2影响更强，与文献一致。这反映CHIKV复制复合体在质膜球状体形成，依赖压力颗粒动态（nsP3劫持G3BP避免防御）和高尔基-质膜交通。

EBOV筛选结果：组蛋白修饰酶与泛素化途径的角色

EBOV复制子整合4cis系统（NP、VP35、VP30、L），转录Zeocin-eGFP小基因组，稳定>90% eGFP。敲除L或DYNLL1（已知复制因子）降低信号，NPC1（入口受体）无影响。筛选富集独特基因：组蛋白修饰酶（EHMT1/2、EP300）、泛素家族（FBXO28、USP7/12）、磷酸酶/激酶（DUSP6/18、PPP1R12B/3CB、PRKC1）、免疫球蛋白超家族（CD19、ICAM4）和转录调控因子（NRIP1、PSIP1、ZNF182/865）。

验证七个一致命中和九个额外基因：EHMT1、EHMT2、USP7显著降低eGFP。链特异RT-qPCR显示敲除减少vRNA、cRNA、mRNA。瞬时转染确认不是4cis整合效应，4cis蛋白表达不变。这暗示EHMT1/2（赖氨酸甲基转移酶）和USP7（去泛素酶）调控EBOV复制，可能通过非组蛋白甲基化或VP35/NP泛素化，与Sendai病毒包容体形成类似。

结果验证与比较：病毒特异性与方法可靠性

候选基因使用单个敲除、流式细胞术、Western blot和RT-qPCR验证，编辑效率高。DENV-2和CHIKV在活感染确认，EBOV用瞬时系统。比较显示特异性：DENV-2偏ER蛋白稳态，CHIKV涉压力和高尔基，EBOV偏表观遗传调控，与HEV早期内体依赖不同。

方法鲁棒：Brunello覆盖全，MAGeCK分析可靠。RNA测序显示DENV-2复制子稳定（99.9%匹配）。局限包括报告子偏倚和培养漂移，但交叉验证缓解。

研究观点：补充工具与潜在应用

复制子CRISPR筛选补充活病毒方法，专注下游因子，适用于BSL-2，揭示病毒特异机制。该研究报告新因子，如DENV-2翻译调控和EBOV甲基转移酶作用。这些提供宿主导向抗病毒靶点，减少潜在风险。

展望：扩展至更多病毒，结合CRISPRi/a分析必需基因，或蛋白质组学绘网络，深化病毒-宿主互动。最终，或开发广谱药物靶向保守通路，如EMC/OST，应对疫情。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-65979-3