无需血培养的双相法实现干燥全血基质中病原体的快速灵敏检测

血流感染（BSLs）通常与严重疾病相关，特别是对有危重症患者，常导致高发病率和死亡率。然而，目前诊断BSIs的临床金标准仍然是血培养后的核酸扩增和PCR检测。血液培养除了步骤过于缓慢和繁琐，还面临敏感性不够理想、不能鉴别生长缓慢的病原体、不能鉴别有抗生素治疗史的BSIs患者的病原体，以及无法对患者进行初始管理和干预。此外，在缺乏及时可靠的诊断结果时，如果在没有进行任何患者分层的情况下服用了强效广谱抗生素，可能出现耐药和非典型病原体的情况。综上，快速和准确地识别血液中的感染性微生物仍然是一个重大的诊断挑战。

研究内容

本文介绍了一个血液处理模块，通过高温干燥血液基质来创建了多孔微流体和纳米流体网络，其目的是为后续等温扩增中聚合酶和引物的进入提供入口和微环境。加入酶和引物后，在干燥的血液基质中启动单分子敏感性扩增，避免了传统DNA纯化的需要。扩增完成后，产物会扩散到上清液中，而干燥的血液基质固相不与上清重新混合，通过检测上清液的荧光就能进行信号的读出。在这个平台中,干燥的全血不参加反应,而是作为底物去抑制影响等温扩增反应的元素,如血小板细胞,和蛋白质等。此外，干燥的血固相不与上清重新混合，使高血红素锁定在红细胞的背景中，而放大后的荧光扩增子集中在清晰的上清相中，即使每个反应体积的血量超过20%，也会产生明显的荧光变化。

研究方法

作者设计了双相扩增过程。在标准0.2 mL PCR管中加入4 μL添加了病原体DNA的全血，然后在加热器中快速干燥血液（37℃ 20分钟）。扫描电镜图像显示，干燥后的血液变成固体基质或薄片，孔隙率约为5.2%。紧接着，向其中加入扩增缓冲液和试剂（不含引物和聚合酶），随后在干燥血液基质中进行95℃ 2分钟的湿热裂解，生成多孔物理网络结构。在65℃到95℃不同温度下热裂解的SEM表征显示出微米级的孔隙和网络。图像分析显示，干燥血液基质的孔隙率从65℃裂解温度下的~10%增加到95℃裂解温度下的60%以上。因此，选择95℃作为最终热裂解温度。在热裂解步骤后，可以在干燥的血液基质中看到物理微流体和纳米流体网络。

LOD评估

为了评估双相分析对游离DNA的检测范围和LOD，作者添加了一系列稀释的金黄色葡萄球菌（MRSA）和大肠杆菌（E. coli）DNA。为了验证干燥步骤和干燥的血液基质是否为游离DNA检测提供了足够的灵敏度，作者没有进行热裂解步骤。孔隙度模拟结果表明，低孔隙度（~5%）时，酶很难扩散接触血液基质内的目标DNA；但孔隙度提高（~67%），基质内DNA被酶接触的概率大大提高。在无热裂解控制的血液反应中，两种反应的检出限均为100拷贝/4 μL血液。相比之下，双相反应中利用热裂解，两种情况下（图D和E）的LOD均为1 copy/4 μL全血，表明其单分子敏感性。

结论

本文提出的方法不需要细菌DNA的纯化和分离，而是直接干燥血液/血液裂解液，使得能够捕获和保留血液基质中的低浓度的细菌或病原体。这也促使该双相方法具有更高的灵敏度，可以在不培养的情况下检测出与败血症相关的低浓度病原体。并且该平台将很容易集成到当前的临床工作流程中，并显著减少BSIs诊断的成本和时间，对血流感染的研究提供新的范例。

参考文献：

Ganguli A, Lim J, Mostafa A, et al. A culture-free biphasic approach for sensitive and rapid detection of pathogens in dried whole-blood matrix [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022, 119(40): e2209607119.