实时荧光定量PCR在水源性致病微生物检测中的应用

水源性疾病在世界范围内已造成严重的发病率和死亡率，成为重要的公共卫生问题。在美国，水源性致病微生物导致每年约715万人患病，11.8万人住院治疗，6630人死亡，直接医疗保健费用为3.33亿美元。世界卫生组织估计每年约有443832名5岁以下儿童以及50851名5～9岁儿童死于腹泻，腹泻疾病多数是由粪便污染的水源所导致。为缓解这一公共卫生事件造成的影响，WHO、美国环保署、欧盟、我国以及其他相关国家制定了水源性致病微生物的具体卫生标准限值。

q-PCR技术原理与检测流程

qPCR是一种通过实时监测脱氧核糖核酸扩增过程中荧光信号积累以实现核酸定量的分子技术，其核心在于荧光标记物与扩增产物的动态关联。与传统PCR相比，qPCR通过引入荧光染料或序列特异性探针，可在每个循环中直接捕获DNA合成量，从而建立初始模板浓度与扩增曲线循环阈值的对数线性关系。

q-PCR在水源性致病微生物检测中的应用

（1）细菌

水体中致病细菌是引发腹泻、霍乱、痢疾及皮肤和组织感染等疾病的主要病原体。根据《生活饮用水标准检验方法 第12部分:微生物指标》（GB/T 5750.12—2023），生活饮用水中的微生物主要通过培养法检测，《饮用水中军团菌检测》（SN/T 2528-2010）规定，饮用水中军团菌的主要检测方法包括培养法、分子生物学技术及血清学鉴定。传统方法虽可靠性高，但耗时较长，难以满足快速检测需要。qPCR可以通过靶向种属特异性基因实现快速定量，显著缩短检测时间。Walker等开发的ybbW基因qPCR法可在6 h内完成检测，对大肠氏埃希菌的特异度和灵敏度达100%。为提高低丰度菌检出率，超滤或免疫磁珠分离可将检测灵敏度提升10～100倍；Wu等通过超滤qPCR联用技术，在4～8 h内完成废水中沙门氏菌的检测。

（2）病毒

水传播肠道病毒因其体积小、感染剂量低及环境抗性强，对人类健康构成威胁。双链DNA病毒因DNA结构稳定性较强，可在水体中存活数周；单链DNA通过频繁的基因重组可以维持高传染性。无包膜病毒因为缺乏脂质外层，对氯消毒的抗性高于包膜病毒，增加了处理难度。现行检测方法EPA Method 1615使用培养法检测病毒，该方法能特异性识别感染性病毒颗粒，但检测周期长，对病毒载量要求高，难以检测诺如病毒等无法在常规细胞系中增殖的病原体。分子生物学技术提高了病毒检测效率与灵敏度，对于dsDNA病毒，qPCR对可靶向保守区基因检出环境样本中的低载量病毒。

结论

环境样品中存在的腐植酸、黄腐酸、酚类化合物、重金属和螯合剂等抑制剂会对qPCR产生干扰并降低检测的灵敏度。解决抑制问题是防止定量水平降低和减少假阴性的关键。评估目标基质中是否存在抑制剂，可以进行内部或外部扩增对照或稀释曲线。EPA推荐的常用外源DNA对照是鲑鱼睾丸DNA，它需要加标已知浓度的外源DNA靶标量化丰度，确定抑制对检测和定量的影响程度。Cao等使用qPCR检测环境水样中的肠球菌时没有准确量化抑制因素，导致目标报告不准确。根据DNA提取物中靶基因拷贝的预期变异性和丰度，可针对样品的一个子集或者全部样品来开展稀释曲线的绘制工作。如果抑制起作用，可以选择最佳稀释度，也可以在qPCR反应中添加蛋白酶抑制剂、甲酰胺或牛血清白蛋白等补充剂增强扩增。

参考文献：

ZHANG X Y, ZHOU W T, XING F X, et al.Application of real-time quantitative PCR in determination of water-borne pathogenic microorganisms[J]. Water Purification Technology, 2025, 44(9): 10-20.