单管多重qPCR技术助力病原微生物检测

目前，用于病原体鉴定的检测方法包括分离培养、抗原/抗体检测及核酸检测等。尽管分离培养是“金标准”，但耗时长、灵敏度低；抗原/抗体检测便捷，但灵敏度和特异性不足，且有窗口期限制。相比之下，核酸检测因其高灵敏度和高特异性而在近年广泛应用于临床。核酸检测技术主要包括聚合酶链反应（PCR）检测和测序技术两大类。PCR检测可进一步区分为单重PCR和多重PCR检测。

多重PCR检测在病原微生物感染中检测精准、覆盖广泛，可以针对各病原体和内参的基因序列设计不同的特异性引物，并对整个引物扩增体系进行优化，确保每一组引物只能特异性扩增一种病原体或内参。在反转录阶段中，由特异性反向引物与相应模板RNA结合进行反转录，得到反转录产物（cDNA）。在PCR扩增反应阶段中，特异性的正向引物和反向引物以DNA或cDNA为模板进行多模板扩增进而产生大量的PCR产物，不同靶点的PCR产物长度不同。PCR扩增产物经过毛细电泳分离，将不同片段大小的PCR产物进行分离，通过对不同长度靶向DNA片段的识别从而判断病原体类型。

研究内容

CE平台基于毛细管电泳技术，具有Sanger测序和片段分析的功能，用于对样本中DNA或RNA进行分析，可应用于临床诊断、口岸检疫、传染病监测、农业育种、药物研发等领域，向用户提供精准的检测结果。基于CE开发的多重荧光PCR-毛细管电泳片段分析技术具有灵敏度和特异性高、通量高、重复性好等优势，已被应用于公安司法、临床医学、农业育种等研究领域。

结果判读

针对病原体设计特异性引物，采用多重PCR技术，在一个反应管中同时对多个靶点进行特异性扩增，最终通过毛细电泳分析，根据扩增片段长度的不同对特定的病原靶点进行区分。

检测结果

本研究共纳入2922例患儿，检出病原体阳性1748例（59.8%），其中1391例（79.6%）为单一病原体检出，357例（20.4%）为2种及2种以上病原体混合检出，病原体检出率排名前三的依次为鼻病毒（39.7%）、合胞病毒（22.8%）及副流感病毒（12.5%），不同病原体在各年龄组儿童中的分布存在差异，肺炎支原体和流感病毒则多见于大于1岁患儿。多重荧光PCR毛细电泳片段分析，满足了大规模样本的多病原检测，且整个试验过程耗时短、时效性好（4h之内最多可完成192例样本检测）。

参考文献：

王中浩, 杨岚, 吴思颖等. 2017-2023年四川省呼吸道病毒感染的流行病学特征分析[J]. 中华预防医学，2024, 58(2)