碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌外膜囊泡引发更强的炎症反应

在本研究中，我们全面比较了一株临床碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant A. baumannii, CRAB）与参考菌株A19606，检测了其耐药谱、体内外免疫激活以及胞外囊泡（外膜囊泡，OMV）的组成和功能。我们发现CRAB不仅对所有测试抗生素耐药，还能在巨噬细胞和感染肺组织中诱导显著更强的MAPK和NF-κB信号通路激活以及更高的细胞因子产生。蛋白质组学分析揭示，CRAB来源的OMV更大，且富集了与分泌和免疫激活相关的蛋白，可作为强效的促炎介质。这些发现阐明了驱动CRAB致病性的双重机制——广泛的耐药性与加剧的宿主炎症反应相结合——并提出了靶向OMV介导的免疫调节的新型干预策略。

介绍

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）在医院环境中，尤其是重症监护室以及免疫功能低下或危重患者中，已成为日益流行且难以应对的病原体。其能获得对多种抗生素（特别是碳青霉烯类）耐药性的显著能力，已严重限制了治疗选择。

关键词

#耐碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌、#外膜囊泡、#炎症反应、#抗生素耐药性

碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant A. baumannii ,CRAB）在全球的迅速传播，促使世界卫生组织将其列为亟需开发新诊断方法、治疗和预防策略的关键优先病原体。CRAB引起的感染与高发病率和高死亡率相关，其主要原因是治疗失败以及该病原体在呼吸机相关性肺炎、菌血症和伤口感染中的作用。

过去十年的广泛研究已阐明驱动鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的多种机制，包括产生OXA型碳青霉烯酶、金属β-内酰胺酶、外排泵上调、孔蛋白改变以及获得移动遗传元件。尽管这些研究极大地增进了我们对CRAB抗菌素耐药性的理解，但对于CRAB在感染过程中如何与宿主免疫系统相互作用的洞察仍然有限。初步研究表明，CRAB感染可能引发免疫反应失调，包括过度释放细胞因子及随之而来的组织损伤。然而，CRAB菌株在激活先天免疫信号的能力上是否与抗生素敏感株或参考菌株不同，在很大程度上仍未得到解答。此外，在受控实验条件下，比较临床CRAB分离株与实验室参考菌株所引发的免疫反应的研究也较为缺乏。

外膜囊泡（Outer membrane vesicles, OMV）已成为革兰氏阴性菌宿主-病原体相互作用的关键介质。OMV是自然分泌的球形双层颗粒，含有蛋白质、脂质、酶、毒素、DNA和RNA，可作为向宿主细胞递送效应分子的载体。在鲍曼不动杆菌中，OMV被认为与免疫刺激、生物膜形成、水平基因转移、抗菌素耐药性传播以及毒力因子递送有关。OMV相关分子，如脂寡糖（LOS）、外膜蛋白A和其他免疫原性蛋白，可激活宿主细胞中的Toll样受体、MAPK和NF-κB通路。尽管如此，与A19606等标准参考菌株产生的OMV相比，CRAB产生的OMV在丰度、大小、蛋白质载物或免疫调节活性上是否存在差异，目前尚不清楚。理解这些潜在差异对于识别可能与抗菌素耐药性协同作用从而加重疾病严重性的毒力特征至关重要。

为了填补这些知识空白，我们采用了一种多学科方法——包括药敏试验、小鼠感染模型、肺组织转录组分析、体外巨噬细胞实验以及对细菌细胞和OMV的蛋白质组学表征——来研究一株临床CRAB分离株与特征明确的参考菌株鲍曼不动杆菌A19606之间的免疫学和分子差异。这种整合策略能够系统性地比较细菌特征、宿主免疫激活以及可能与CRAB致病性相关的OMV特性。

需要指出的是，本研究仅聚焦于单一一株临床CRAB分离株。鉴于CRAB菌株表现出显著的基因组和表型多样性，本文观察到的免疫激活模式和OMV相关特征可能无法代表所有CRAB菌株。

图1 CRAB在小鼠体内诱导更强的免疫反应。

小鼠分别经鼻感染1×107菌落形成单位（CFU）的CRAB或A19606菌株6小时（n=3），随后取肺组织进行RNA测序样本制备。差异表达基因（DEG）的筛选标准为错误发现率（FDR）截断值0.05且倍数变化≥±2。

（A）火山图和（B）热图展示了RNA-seq数据中显著差异表达的基因。

（C）对DEG进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

（D）对DEG进行基因集富集分析（GSEA）。

（E）小鼠分别经鼻感染1×107 CFU的CRAB或A19606菌株24小时（n=6），通过qRT-PCR分析肺组织的基因表达（n=6）。

（F）对苏木精-伊红染色的肺组织切片进行病理组织学分析（n=6）。

比例尺：250 μm。数据以均值±标准差表示；***P < 0.001；****P < 0.0001。

摘要

碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）是一种治疗选择有限的重大院内病原体。尽管CRAB的抗生素耐药性已得到充分研究，但其与宿主免疫的相互作用以及外膜囊泡（OMV）在致病机制中的作用尚不清楚。

我们研究了一株临床CRAB分离株，并将其与参考菌株A19606进行比较。药敏试验显示，CRAB对临床常用抗生素完全耐药，而A19606则对大多数药物敏感。在小鼠鼻内感染模型和骨髓源性巨噬细胞中，与A19606相比，CRAB诱导了显著更强的炎症信号通路激活和更高水平的促炎细胞因子。对感染肺组织的转录组学分析确定了差异表达基因，这些基因富集于炎症反应通路。蛋白质组学显示CRAB中与分泌系统相关的蛋白表达上调。对OMV的特性分析表明，CRAB来源的囊泡富含周质和外膜蛋白，并能引发巨噬细胞更强的炎症信号。CRAB展现出广泛的抗生素耐药性和增强的促炎潜力，部分由其独特的OMV特性介导。靶向OMV形成或宿主免疫调节可能是对抗CRAB感染的有效策略。