随着多重耐药菌的日益增多，尤其是能够形成生物膜的病原体如表皮葡萄球菌，传统抗生素治疗面临巨大挑战。生物膜能够保护细菌免受药物和免疫系统的攻击，导致感染难以清除。噬菌体疗法因其能够特异性裂解细菌而成为一种有前景的替代方案。来自西班牙瓦伦西亚大学整合系统生物学研究所（I2SysBio）的Pilar Domingo-Calap研究员团基于此背景，探索通过定向进化提升噬菌体在生物膜环境下的适应性和疗效。

       研究团队以裂解性噬菌体vB_Sep_Steph1为对象，表皮葡萄球菌ATCC 35984为宿主菌，在生物膜和浮游状态两种条件下，分别使用低滴度（10³ PFU）和高滴度（10⁵ PFU） 的初始噬菌体进行20代连续传代进化（图1）。共设立了12个独立进化 lineage，并在进化前后对噬菌体进行全基因组测序，结合表型分析（如裂解活性、复制适应性、抗性抑制能力）评估进化效果。

图1 定向进化实验设计

研究发现特别是在生物膜条件下进化的噬菌体，其裂解活性和复制适应性显著提升，部分lineage在低滴度下仍能有效抑制细菌生长，并且延迟了细菌抗性株的出现（图2-图4）。

图2 在生物膜和浮游条件下孵育4小时后的噬菌体扩增（生物膜进化株（尤其D/F）展现了在不同环境下都能高效繁殖的普适适应性）

 图3 噬菌体接种对生物膜和浮游状态4小时培养后细菌生长的影响（浮游进化株（尤其J/K/L）展现了最强的瞬时暴力杀菌能力，这可能得益于其RBP基因的优化）

图4 生物膜与浮游状态下噬菌体攻击引发的细菌生长动力学响应（高滴度生物膜进化株（D/E/F）虽然在4小时的即时杀菌中不是最突出的，但由于可能调整了裂解时间（穿孔素突变）和吸附策略，它们能够更有效地与细菌长期周旋，最大限度地延缓了耐药菌的出现）

进化后的噬菌体在不同条件下表现出条件依赖的突变模式，突变主要集中在编码尾纤维蛋白和具有解聚酶活性的结构蛋白（CDS_0156）的基因区域，这些蛋白与宿主识别和生物膜降解密切相关（图5、图6）。此外，研究还发现holin基因的突变可能与噬菌体在生物膜环境中的裂解时间调控有关，高频突变（深色）几乎只出现在高滴度的生物膜进化谱系（D, E, F）中。穿孔素控制噬菌体的裂解时间，这暗示生物膜环境可能选择了裂解时间发生改变的突变体，以适应该环境下的传播。

图5 不同进化条件下噬菌体基因组中累积突变的分布

图6 进化噬菌体谱系中发生突变的编码序列（CDSs）

研究证明，通过模拟目标感染环境（特别是生物膜条件）进行定向进化，可以有效筛选出更具治疗潜力的噬菌体候选株，为应对 biofilm-associated 的多重耐药菌感染提供了新策略。

参考文献链接：https://doi.org/10.1038/s41522-025-00893-6