CRISPR酵母工厂：基因编辑酵母分泌噬菌体溶菌酶，高效狙击李斯特菌

单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，可在冷藏环境中生存，污染乳制品、即食食品等，引发严重甚至致命的人类感染。传统抗生素治疗面临耐药性挑战，亟需开发新型、安全且高效的抗菌策略。噬菌体溶菌素（Endolysins）是一类能特异性水解细菌细胞壁肽聚糖的酶，具有高度特异性、不易产生耐药性，且对有益微生物影响小，是理想的抗生素替代品。其中，Ply511溶菌素对单增李斯特菌所有血清型均具有活性，显示出巨大的应用潜力。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种公认安全（GRAS）的微生物，被广泛用于异源蛋白的表达和展示。本研究首次利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了能够稳定表达并分泌Ply511溶菌素的工程化酵母菌株，为食源性病原体的生物防治提供了一种创新、稳定且无标记的平台。

基因工程菌株的构建：CRISPR-Cas9实现稳定、无标记整合

研究团队采用CRISPR-Cas9系统，将Ply511溶菌素的表达盒精确整合到酿酒酵母CEN.PK113-7D的染色体特定位点（X-4，XI-3，XII-5）。这种方法实现了无抗生素筛选标记、无疤痕的染色体整合，确保了遗传修饰的长期稳定性和生物安全性，更适合食品或治疗应用。研究构建了两种形式的工程酵母。表面展示型：将Ply511与酵母细胞壁蛋白Sed1锚定融合，展示在酵母细胞表面；分泌型：去除锚定蛋白序列，利用Sed1信号肽引导Ply511分泌到细胞外。通过诊断PCR和荧光显微镜（利用V5标签抗体）证实了蛋白质的成功表达与定位。

功能验证：展示型无效，分泌型大显身手

展示型酵母的局限性：尽管表面展示的Ply511在热灭活李斯特菌平板上显示出酶活性（能降解肽聚糖形成透明圈），但在与活菌共培养时，并未表现出显著的杀菌效果。研究人员分析，这可能是因为锚定在细胞壁上的酶空间受限，无法有效扩散并接触细菌的肽聚糖底物。此外，携带三个拷贝展示盒的酵母生长受到明显抑制。相比之下，分泌型工程酵母（在三处位点整合了分泌表达盒）生长未受影响，且展现出强大的抗李斯特菌能力。

强大的抗菌效能：细胞、上清液与裂解液均有效

研究系统评估了分泌型工程酵母不同组分的抗菌活性：

完整细胞：与李斯特菌共培养24小时后，工程酵母细胞能显著降低细菌数量。

浓缩培养上清液：将工程酵母的培养上清液浓缩10倍后，对三种不同血清型（1/2c，4b，4c）的李斯特菌均表现出快速杀菌活性，作用6小时即可降低1.3至4.2个对数值（log10 CFU/mL）。尤为重要的是，该上清液在牛奶基质中（4°C冷藏条件下）仍能持续发挥抗菌作用，48小时后杀菌效果显著，这为其在易污染的乳制品保鲜中的应用奠定了基础。

酵母细胞裂解提取物：这是效果最强的形式。工程酵母的裂解提取物对李斯特菌的杀灭作用极为彻底，对于血清型1/2c和4b，作用24小时后已检测不到活菌；对于血清型4c，也降低了约6.5个对数值，效果远超野生型酵母的裂解物。

作用机制与应用前景分析

研究表明，分泌是比表面展示更有效的溶菌素递送策略。分泌的Ply511能自由扩散并作用于细菌细胞壁。有趣的是，即使经过洗涤的酵母细胞也具备抗菌活性，提示部分溶菌素可能被导向细胞膜或在其代谢过程中释放。

该研究构建的酵母平台具有多重优势：

安全稳定：使用GRAS微生物和CRISPR无标记整合技术。

高效广谱：对包括高致病性血清型4b在内的多种李斯特菌有效。

应用灵活：既可作为一种“活性益生菌”在食品或肠道中持续产生抗菌物质，也可将其培养上清液或裂解物作为“后生元”或天然生物防腐剂直接使用。

潜力巨大：此平台可扩展至表达针对其他病原体的溶菌素，成为一种通用的病原体生物防治工具。

结论与未来展望

本研究成功利用CRISPR-Cas9技术，创建了能稳定分泌抗李斯特菌溶菌素Ply511的工程化酿酒酵母。该平台突破了传统质粒表达的不稳定性问题，并通过分泌策略实现了高效的抗菌效果，尤其在食品基质中展示出应用潜力。

这项工作为开发新型、安全的食品生物保鲜剂和潜在的治疗性益生菌提供了创新思路。未来研究可进一步优化分泌效率，评估其在复杂食品体系和动物模型中的功效与安全性，推动这一绿色、精准的抗菌策略走向实际应用。

参考文献：[1]Moreno DS, Cunha J, de Melo LDR, et al. CRISPR-Cas9 engineered Saccharomyces cerevisiae for endolysin delivery to combat Listeria monocytogenes. Appl Microbiol Biotechnol. 2025 Apr 2;109(1):81.