枯草芽孢杆菌在工业、农业中应用广泛，但也可能导致食品腐败和机会性感染。现有检测方法如培养法、PCR、免疫学等存在耗时长、无法区分活菌、易受复杂基质干扰等局限。因此，亟需开发一种快速、灵敏、特异且能检测活菌的新技术。噬菌体来源的裂解酶及其细胞壁结合域（CBD）具有高亲和力和特异性，可作为理想的识别元件，但此前在枯草芽孢杆菌检测中应用较少。

由中国山东省农业科学院畜牧兽医研究所及华中农业大学的研究团队联合发表了题为“A Rapid and Sensitive Detection Cascade for Bacillus subtilis Vegetative Cells Utilizing Phage-Derived CBD and Lysin”的研究性论文，该研究开发了一种基于噬菌体PJNB032来源的裂解酶及其细胞壁结合域的级联检测系统，在土壤、饲料、水等复杂基质中表现出高准确性和重复性，为工业发酵质量控制和环境监测提供了有力工具。

研究人员从噬菌体PJNB032中鉴定出一个新型裂解酶proLysin，其CBD包含一个SH3和两个LysM结构域，能特异性识别枯草芽孢杆菌营养细胞。通过重组表达获得三种蛋白：荧光标记的proe-CBD（eGFP融合）、无标记的pro-CBD以及全长proLysin（图1）。基于这些蛋白，研究人员建立了一个三级级联检测系统：第一步为定性荧光筛选，将proe-CBD与待测菌孵育10分钟，通过荧光显微镜初步识别枯草芽孢杆菌营养细胞；第二步为定量免疫磁捕获，优化确定最佳蛋白包被浓度为40 μg、磁珠体积15 μL、捕获时间15分钟，建立荧光强度与菌浓度的回归方程（R²=0.996）（方案1、图3）；第三步为酶特异性验证，使用4 μg proLysin处理30分钟，通过裂解引起的OD₆₀₀下降确认靶标菌身份。

图1 裂解酶特征及proe-CBD的重组蛋白构建

方案1 三级检测流程图                       

 图2 定量免疫磁珠捕获参数优化

结果显示，proe-CBD能特异性结合枯草芽孢杆菌营养细胞，且不受pgcA基因缺失的影响。proLysin对23株受试枯草芽孢杆菌均表现出裂解活性（相对酶活性 ≥ 77%），而对13株非靶标菌（如蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等）无任何裂解作用，其广谱性优于原始噬菌体PJNB032（仅裂解15株）。重组蛋白pro-CBD在pH 4–10和4–50℃范围内保持较高活。通过16S rRNA基因测序验证，酶法鉴定100%准确（图4）。

图4 proLysin在枯草芽孢杆菌特异性鉴定中的开发与应用

此外，在土壤、饲料和水样中的加标回收实验显示回收率为95%–113%，相对标准差为2.68%–13.73%，表明该方法快速（10–30分钟）、灵敏、特异且可靠，适用于发酵过程监控、环境监测等场景中对枯草芽孢杆菌活菌的实时检测。

参考文献链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07819