武汉病毒所杨航团队利用T4噬菌体平台高效设计抗新城疫病毒即用型多表位疫苗

在新突发传染病频发的背景下，能够诱导强效、持久免疫应答的通用疫苗设计策略仍面临诸多挑战。为应对这一关键科学与公共卫生需求，中国科学院武汉病毒研究所杨航研究员领衔的多学科交叉团队合作在《Antiviral Research》上在线发表了题为“Harnessing T4 phage-based platform for efficient design of ready-to-use multiepitope vaccines”的研究文章。

本研究构建了一种基于T4噬菌体的模块化疫苗平台，旨在实现多表位疫苗的快速构建与即用化部署。本研究以严重威胁全球养禽业的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）为模型病原体开展概念验证。首先，通过跨毒株保守性分析与中和表位预测，从NDV血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白中鉴定并筛选出高度保守的线性表位，命名为HN2；随后，将HN2表达序列以三重复形式（3×HN2）融合至T4噬菌体小外壳蛋白（Soc）的C端，构建嵌合抗原Soc-3HN2。经体内外动物模型评价证实其可有效激活体液与细胞免疫应答后。随后利用Soc蛋白与T4噬菌体衣壳高亲和力结合的特性，将纯化的Soc-3HN2蛋白偶联至T4噬菌体颗粒表面，并在动物模型上验证展示型疫苗的有效性。在此基础上，进一步采用CRISPR-Cas12a介导的精准基因编辑技术，将编码3HN2的序列无缝插入T4噬菌体基因组中soc基因的3′端，实现抗原在子代噬菌体衣壳表面的组成型、稳定表达，最终获得遗传稳定的工程噬菌体疫苗—3HN2-T4。在动物攻毒保护试验中，点眼鼻滴3HN2-T4即可提供100%的免疫保护，显著抑制病毒复制与排毒，减轻靶器官的炎症浸润与组织病理损伤，其综合保护效力优于市售商品化活疫苗LaSota株。本研究不仅系统证实了T4噬菌体作为多功能、即用型疫苗平台的可行性与优越性，更建立了“表位筛选—载体适配—体内整合”的即用型T4噬菌体多表位疫苗开发范式，为应对新突发传染病提供了可扩展、可移植的技术路径与通用解决方案。

针对保守表位（抗原的遗传保守区域，在变异中保留）的疫苗策略已成为下一代疫苗开发的合理途径。目前已报道多种针对不同病原体的多表位疫苗，并在临床前研究和临床试验中显示出强大的免疫原性和显著的临床疗效。表位抗原的提呈方式对免疫反应的质量、大小和持久性有重要影响。迄今为止，在亚单位疫苗的开发中，病毒样颗粒已被证明是一种非常有效的抗原递送平台。T4噬菌体衣壳由930个主衣壳蛋白gp23亚基、870个小外衣壳蛋白（Soc）和155个高分子量抗原外衣壳蛋白（Hoc）组成。非必需的外衣壳蛋白Soc和Hoc作为抗原展示的强大平台，可以在没有外源佐剂的情况下高效激活先天和适应性免疫反应。本研究以新城疫病毒为例报道了利用T4噬菌体平台开发即用型表位疫苗的通用流程（图1）。具体包括：

1．表位筛选

利用团队前期开发的比较表位组学技术对免疫学表位数据库（IEDB）中记录的所有线性血凝素-神经氨酸酶（HN）B表位进行了系统分析，综合考虑序列相似性、文献报道的频率、以及实验验证的数量筛选出最优表位HN1和HN2。

2.AI驱动的抗原设计

通过蛋白计算等策略设计合理的表位抗原。

3.基于噬菌体展示的抗原递送策略优化

通常的递送策略是体外组装，即通过将表位与T4噬菌体Soc蛋白的C末端融合，构建了一个多表位抗原Soc-3HN2，并通过纯化的Soc-表位抗原与soc缺失的T4噬菌体孵育（ΔT4），将Soc-3HN2固定在T4噬菌体表面。去除未结合的游离蛋白，纯化获得ΔT4-Soc-3HN2噬菌体展示疫苗。

体外组装策略所构建疫苗的生产过程十分繁琐且耗时，这是因为需要进行多次纯化和分离步骤，并且抗原与噬菌体的结合效率各不相同，这阻碍了大规模生产的可扩展性和可重复性。为了解决这些问题，我们利用CRISPR-Cas12a介导的精准基因编辑技术，将编码3HN2的序列无缝插入T4噬菌体基因组中soc基因的3′端，从而构建了即用型工程噬菌体疫苗3HN2-T4。这种策略利用了强大的天然Soc启动子来驱动Soc-3HN2融合蛋白的表达，使得T4噬菌体在大肠杆菌内复制的过程中能够同步产生多表位抗原，并可控地展示到T4噬菌体的衣壳上。

4.即用型T4噬菌体疫苗保护效果评价

以野生型T4（WT-T4）和商品化减毒活疫苗LaSota株为对照，在动物感染模型中评价即用型T4噬菌体疫苗3HN2-T4的保护效果。

图1.基于T4噬菌体平台的多表位疫苗设计流程利用上述策略，研究团队构建了针对新城疫病毒（NDV）的即用型T4噬菌体表位疫苗3HN2-T4并在动物感染模型上评价了候选疫苗的免疫原性和保护效力（图 2a）。结果显示，接种高剂量3HN2-T4噬菌体疫苗的动物体重增长保持稳定（图 2b），在整个观察期内均保持健康状态，未出现新城疫（ND）的临床症状，并且维持正常的采食量和活动水平。相比之下，接种WT-T4疫苗的组在感染后第3天就出现了典型的ND临床表现（图 2c）。从保护效果上看，3HN2-T4噬菌体疫苗表现出剂量依赖性的保护效果，高剂量组的保护效果与商业疫苗相当（图 2d）。此外，高剂量的3HN2-T4噬菌体疫苗产生了高水平的HI抗体滴度（图 2e），表明其具有较强的免疫原性。从病理上看，接种WT-T4的组在胃囊和十二指肠中清晰可见广泛的出血性病灶、黏膜充血和坏死——这些都是新城疫的典型病理特征（图 2f）。宏观观察和组织学评估结果显示，在高剂量的3HN2-T4噬菌体免疫组中，组织结构保存完好，表明接种疫苗能有效防止病毒侵袭后的全身性病理损伤（图 2g）。组织病理学分析表明，高剂量3HN2-T4疫苗组的肺部病变严重程度显著降低，而WT-T4对照组出现了严重的肺泡破坏、间质增厚、弥漫性炎症浸润和肺水肿（图 2g）。在肠道组织中，WT-T4组显示出明显的上皮坏死、密集的炎症细胞浸润和广泛的黏膜完整性破坏。高剂量3HN2-T4噬菌体疫苗组中口腔和泄殖腔拭子检测到的病毒脱落量均显著低于商业化减毒活疫苗LaSota疫苗组（图 2h）。这些发现为3HN2-T4噬菌体疫苗抑制新城疫病毒复制并降低病毒在动物间的传播提供了有力证据。

图2. 3HN2-T4噬菌体疫苗诱导显著且全面的免疫保护。（a–d）动物攻毒保护实验设计。SPF鸡（n = 15/组）经肌肉注射接种不同剂量的3HN2-T4噬菌体疫苗（30 μg 或 20 μg）、商品化减毒活疫苗LaSota疫苗（阳性对照）或野生型T4噬菌体（WT-T4；阴性对照）。末次免疫后第14天，所有动物接受鼻内攻毒，剂量为1×10⁴ EID₅₀/只（NDV F48E9强毒株）。攻毒后连续14天动态监测体重变化（b）、临床症状评分（c）、存活率（d）。（e）加强免疫后第14天采集血清，测定新城疫病毒特异性血凝抑制（HI）抗体滴度。（f）大体病理剖检。（g）肺组织H&E染色切片的组织病理学评估（h）攻毒后第3、5、7、9口咽和泄殖腔拭子中的病毒脱落水平检测。

本文亮点：

1.利用比较表位组学技术构建了具有免疫保护效果的新城疫重组表位抗原3HN2。

2.通过体外组装的方式构建了基于T4噬菌体载体的新城疫疫苗ΔT4-Soc-3HN2。

3.将有效的表位抗原插入T4噬菌体基因组，构建的即用型T4噬菌体表位疫苗3HN2-T4在动物模型上完全保护致死剂量的新城疫病毒攻击。

4.建立了T4噬菌体表位疫苗的通用构建策略，为应对新突发传染病提供了可扩展、可移植的技术路径与通用解决方案。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166354226001087