南京农大闫丽萍教授团队揭示hnRNP D通过抑制先天免疫反应促进流感病毒复制新机制

近日，南京农业大学动物医学院闫丽萍教授团队在《Journal of Virology》上发表了题为《Cellular hnRNP D promotes influenza A virus replication by inhibiting TBK1-IRF3-mediated innate immune response》的文章。首次揭示了宿主蛋白hnRNP D对于甲型流感病毒（IAV）存在双重调控作用。一方面，hnRNP D作为 IAV 聚合酶的负调控因子，会干扰vRNP的组装与聚合酶活性；另一方面，病毒感染会导致hnRNP D积累增加，从而进一步增强其对先天免疫系统的抑制作用，显著促进病毒复制。研究发现，hnRNP D通过与IRF3相互作用，抑制IRF3与TBK1之间的结合，阻断TBK1对IRF3的磷酸化激活及后续干扰素的产生，从而使得病毒复制增强。该研究明确了在IAV复制过程中宿主因子hnRNP D 的功能，为抗病毒治疗提供了潜在靶点。

摘要：

异质性核核糖核蛋白（hnRNPs）在甲型流感病毒（IAV）的生命周期中发挥着重要作用。团队先前通过质谱分析发现，细胞内的hnRNP D是IAV聚合酶碱性亚基2（PB2）蛋白的一个新型相互作用伴侣，然而hnRNP D在IAV复制中的功能意义及其作用机制仍不清楚。本研究证实，hnRNP D不仅直接与A/Puerto Rico/8/1934（PR8，H1N1）毒株的PB2蛋白相互作用，还能与病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）中的其他蛋白结合，这些相互作用共同抑制了vRNPs的组装及病毒聚合酶活性。值得注意的是，hnRNP D能显著提高IAV在A549细胞中的病毒滴度。从机制上看，hnRNP D可抑制干扰素（IFN）-β启动子的激活，并降低I型IFN信号通路下游因子的mRNA水平。具体而言，hnRNP D能阻断关键抗病毒蛋白诱导的IFN-β启动子激活，并与干扰素调节因子3（IRF3）发生强效相互作用。更重要的是，hnRNP D可阻止TANK结合激酶1（TBK1）与IRF3的结合，从而抑制IRF3的磷酸化及激活。综上所述，研究揭示了IAV利用宿主RNA结合蛋白hnRNP D实现自我复制的新型免疫逃逸策略。本研究不仅阐明了病毒-宿主相互作用中复杂的权衡机制，还确定hnRNP D可作为增强抗病毒免疫的潜在治疗靶点。

研究亮点：1

宿主蛋白hnRNP D能够与IAV的PB2蛋白存在互作

团队使用质谱鉴定出宿主RNA结合蛋白hnRNP D与PB2蛋白存在相互作用，并构建hnRNP D p45表达载体，进一步通过免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down与激光共聚焦试验验证了二者之间的相互作用并且在细胞核中存在共定位现象。通过构建hnRNP D与PB2蛋白截短体，并进行Co-IP，研究发现hnRNP D的所有结构域均能与PB2存在蛋白互作，而PB2蛋白的C端是其主要的互作结构域。

图1：hnRNP D与PB2蛋白互作A：宿主蛋白与PR8 PB2的相互作用网络；B：hnRNP D与外源及内源PB2的相互作用；C：GST pull-Down显示的直接相互作用；D：HEK293T细胞中Flag-hnRNP D和Myc-PB2的共定位；E：A549细胞中Flag-hnRNP D与PB2的共定位；F：hnRNP D与PB2的截短体示意图；G：hnRNP D截短体与PB2的相互作用；H：PB2截短体与hnRNP D的相互作用。

2. hnRNP D可抑制PR8毒株的聚合酶活性及vRNP组装

鉴于PB2蛋白是IAV vRNP的重要组成部分，团队进一步探究了hnRNP D对vRNP及聚合酶的功能影响。通过检测过表达和干扰hnRNP D后PR8的聚合酶活性，研究证实了hnRNP D能够抑制病毒聚合酶活性，其中RRM和QRD结构域均发挥作用。WB和Co-IP检测结果显示，hnRNP D能与PB1、PA和NP蛋白相互作用，并且特异性降低了PA蛋白表达水平。基于这些多重相互作用，团队接下来使用NP抗体进行Co-IP，结果hnRNP D过表达显著降低了与NP互作的PA、PB1和PB2蛋白水平。这些结果表明hnRNP D具有抑制IAV聚合酶活性及vRNP组装的功能。

图2：hnRNP D抑制病毒聚合酶活性及vRNP组装A：过表达hnRNP D对PR8聚合酶活性的影响；B：干扰hnRNP D对PR8聚合酶活性的影响；C：hnRNP D截短体对PR8聚合酶活性的影响；D：hnRNP D对PB2、PB1、PA及NP蛋白水平的影响；E：hnRNP D与PB1、PA及NP蛋白相互作用；F：hnRNP D破坏vRNP组装。

3. hnRNP D促进A549细胞中IAV的复制

团队进一步研究了hnRNP D对完整病毒复制周期的影响。出乎意料的是，在A549细胞中过表达hnRNP D会导致PR8病毒感染后病毒PB2和NP蛋白水平显著升高，而敲低内源性hnRNP D表达时，则显著降低了病毒蛋白水平和上清液中的病毒滴度，并且这一效果在多种病毒株感染模型中得到一致地证实。为探究hnRNP D抑制聚合酶活性与其整体促病毒表型之间的矛盾，团队建立Vero E6细胞（一种干扰素分泌缺陷型细胞系）感染模型，并发现在Vero E6细胞中过表达hnRNP D可降低PB2蛋白、NP蛋白的表达水平，并降低PR8毒株的病毒滴度，证明hnRNP D在A549细胞中的促病毒表型与先天免疫调控密切相关。

图3：hnRNP D在A549细胞中促进IAV复制A：过表达hnRNP D可提高病毒PB2和NP蛋白水平；B：敲低hnRNP D可降低病毒PB2和NP蛋白水平；C：敲低hnRNP D可抑制PR8复制；D-E：过表达hnRNP D能促进H3N1和H9N2的复制；F-I：敲低hnRNP D会抑制H3N1和H9N2的复制；J-I：过表达hnRNP D抑制了PR8毒株在Vero E6细胞中的复制。

4. hnRNP D可抑制先天免疫信号通路中IFN-β的生成

团队接下来探究了hnRNP D在调控宿主抗病毒反应中的作用。双荧光素酶报告基因显示，hnRNP D能剂量依赖性地抑制仙台病毒（SeV）和Poly (I:C)诱导的IFN-β启动子及ISRE转录元件的激活。并且在HEK293T细胞中过表达hnRNP D后，经紫外线照射灭活的细胞上清液能够促进表达GFP的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）的复制，表明hnRNP D具有抑制抗病毒因子分泌的能力。荧光定量PCR分析表明，hnRNP D的过表达显著抑制了A549细胞中由SeV、Poly(I:C)和PR8病毒诱导的IFNB1、ISG15、IFIT1、OASL、TNF及IL8基因的转录，证明宿主蛋白hnRNP D是RNA病毒激活的I型IFN免疫反应中的负向调节因子。

图4：hnRNP D可抑制hnRNP D可抑制I型IFN信号通路A：过表达hnRNP D能抑制SeV诱导的IFN-β启动子及ISRE的激活；B：表达hnRNP D能抑制Poly (I:C)诱导的IFN-β启动子及ISRE的激活；C：过表达hnRNP D可促进VSV-GFP的复制。

图5：hnRNP D可抑制ISGs及炎症细胞因子的mRNA水平A：SEV刺激；B：Poly (I:C)刺激；C：PR8刺激。

5. hnRNP D通过靶向IRF3磷酸化来减弱先天免疫反应

团队进一步确定了hnRNP D在先天免疫信号传导级联中的作用靶点。通过检测IFN-β启动子的激活情况，发现hnRNP D能够抑制RIG-Ⅰ-IRF3诱导的IFN-β启动子激活，并与IRF3表现出强烈的相互作用，且hnRNP D的各个结构域均能与IRF3结合，其中QRD是抑制IRF3诱导的IFN-β启动子激活的关键结构域。通过检测IRF3的磷酸化水平，团队发现在IAV感染期间，hnRNP D的过表达显著抑制了IRF3的磷酸化。进一步研究hnRNP D与TBK1的关系发现，hnRNP D能剂量依赖性地降低与TBK1共沉淀的IRF3水平。研究结果阐明了hnRNP D通过结合IRF3并阻止其被TBK1磷酸化，从而削弱下游干扰素反应，进而抑制抗病毒先天免疫。

图6：hnRNP D可抑制RIG-I-IRF3-IFN-β信号通路的激活A：过表达hnRNP D能抑制RIG-I至IRF3介导的IFN-β启动子激活；B：hnRNP D与RIG-I-IRF3通路中的关键蛋白发生相互作用。

图7：hnRNP D通过阻断TBK1与IRF3的相互作用来抑制IRF3的磷酸化A：hnRNP D与IRF3发生相互作用；B：HEK293T细胞中Flag-hnRNP D与Myc-IRF3的亚细胞定位分析；C：A549细胞中Flag-hnRNP D与IRF3的亚细胞定位分析；D：hnRNP D与IRF3相互作用域的鉴定；E：hnRNP D中的QRD结构域可抑制IRF3诱导的IFN-β启动子激活；F：hnRNP D抑制了PR8诱导的IRF3磷酸化激活；G：hnRNP D降低了与TBK1相互作用的IRF3蛋白水平。

综上，该团队确定宿主蛋白hnRNP D p45是IAV的正向调节因子，其作用机制涉及双重调控途径。尽管hnRNP D会抑制IAV聚合酶活性，但在A549细胞模型中，它却能正向调控病毒复制，这一作用与其抑制先天免疫反应的功能密切相关。团队证明IAV能够通过劫持hnRNP D的表达来抑制TBK1激酶对IRF3的激活，从而降低IRF3的磷酸化水平，抑制先天免疫反应，显著促进病毒复制。

图8：hnRNP D在IAV复制中的双重作用机制模型

原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.00257-26