Biofilm：表面活素加速枯草芽孢杆菌菌膜型生物膜的发育

表面活素是一种脂肽类生物表面活性剂，枯草芽孢杆菌很多菌株都会产生它。过去大家已经知道，它能降低表面张力，帮助菌群滑动和扩散，也能作为信号分子，甚至还有一定抗菌作用。但一说到生物膜，结论就不统一了。有的研究说它很重要，缺了它生物膜会明显受损，有的研究却说把表面活素合成基因删掉，生物膜看起来还是能形成。作者想解决的，正是这个到底是不是重要，以及重要在哪里的问题。

枯草芽孢杆菌能形成多种类型的生物膜，比如固体表面的菌落型生物膜、液体里的附着型生物膜，以及液气界面上漂浮的pellicle 生物膜，也就是菌膜型生物膜。作者选择重点研究 pellicle，是因为这种生物膜特别适合看发育速度这件事。它不像普通菌落那样主要靠原地扩增长出来，而是需要细胞先在液体中游动、找到液面、再在合适时间一起切换到定居和产基质状态，最后把整个液面封成一层膜。所以如果某个因子影响的是形成得快不快，pellicle 就特别容易看出来。

在方法上，作者用了 12 株天然分离的枯草芽孢杆菌土壤菌株，再给每一株做了一个对应的 ΔsrfAC 突变株，也就是不能正常产生表面活素的版本。然后把这些菌接种到富营养、促生物膜形成的 LBgm 培养基里，在 30 摄氏度 下静置培养，并用一个自动成像系统每 30 分钟 拍一次图，连续跟踪 48 小时。作者没有靠主观印象判断，而是先定义什么时候算 pellicle 形成，具体就是液面中央突然从透明变成一层连续的不透明薄膜，把整个液面盖起来。之后再结合图像颜色值变化，把这个时间点系统地量化出来。简单说，他们不是只看终点照片，而是真正给每个菌株画出了一条什么时候封住液面的时间线。

文章最先得到的结果是，这 12 株天然菌总体上 pellicle 形成时间其实相当接近，大多数都在 20 到 25 小时之间就能形成液面膜，但其中有一株特别突出，叫 MB9_B4。这株菌形成 pellicle 的时间大约是 30.92 ± 2.84 小时，比它一个很接近的同来源菌株 MB9_B1 明显慢很多。作者之前已经知道，MB9_B4 本身就缺乏强的表面活素产生能力，所以他们立刻怀疑，这个延迟很可能和表面活素有关。为了验证这一点，作者把 12 株菌都和各自的 ΔsrfAC 突变株进行了比较。结果很清楚，在 12 株里有 9 株，删除表面活素合成能力后，pellicle 形成时间都显著延后。比如 MB8_B1 从大约 22.67 小时推迟到 39.58 小时，延后将近 17 小时；P5_B1 从 19.83 小时推迟到 32.00 小时，延后大约 12 小时；还有不少菌株会延后 3 到 8 小时左右。这说明，对大多数菌株来说，表面活素确实会影响 pellicle 出现的时间。

但并不是所有菌株都一样，像 MB8_B10、MB9_B4 和 73 这几株，删除 srfAC 后没有出现显著差异。对 MB9_B4 来说，这其实容易理解，因为它本来就不怎么强地产生表面活素，所以再删一次，自然变化不大。可对 MB8_B10 和 73 来说，作者认为可能还有别的未知因素在决定 pellicle 形成时间。这一点很重要，因为它说明表面活素虽然很常见地参与调控，但它并不是唯一的决定因子。

接着作者又提出一个更关键的问题：如果真的是因为缺表面活素才慢，那外加表面活素能不能把这个延迟救回来。他们在培养基里加入了终浓度 20 μM 的纯表面活素，结果非常明显。对大多数 ΔsrfAC 突变株来说，加了表面活素以后，pellicle 形成时间都大幅提前，而且很多时候不只是恢复到野生型水平，甚至比野生型还更快。比如刚才最慢的 MB8_B1 ΔsrfAC，从 43.33 小时直接提前到 28.50 小时；MB9_B4 从 30.67 小时提前到 15.83 小时；MB9_B1 从 25.50 小时提前到 15.17 小时。在 12 株里，除了 P9_B1、P5_B1 和 75 这三株没有达到显著水平外，其余绝大多数都被明显“救回来了”。这基本就从功能上坐实了，表面活素本身确实能推进 pellicle 发育。

文章的一个很重要发现是，表面活素促进的是发育速度，而不是有没有能力最终形成生物膜。这一点从图上特别直观。作者在 20 小时时拍照，发现大多数野生型已经开始形成早期 pellicle，而大多数 ΔsrfAC 突变株还没有封住液面。但到了 48 小时，无论是野生型还是突变株，都能形成相当成熟、很结实的菌膜。这就说明，表面活素并不是 pellicle 绝对必需的建材，不是说没有它就永远长不出来，而更像是一个加速器。它让这个过程来得更早、更快，但并不是唯一让系统最终完成生物膜的因素。

接下来作者想弄清楚，它到底是怎么加速的。他们没有停留在现象层面，而是构建了几个带荧光报告的菌株，去看表面活素会不会影响和生物膜相关基因的表达。作者重点看了三个启动子报告，一个是 epsA，代表胞外多糖 EPS 操纵子表达；一个是 tapA，代表 TasA 纤维相关基因表达；还有一个是 srfAA，代表表面活素合成基因本身。实验对象主要放在那个本身缺乏强表面活素生产能力的 MB9_B4 上。结果显示，加入 20 μM 表面活素后，整体生长曲线看上去没有夸张到完全改变，但红色构成型荧光信号升得更高，提示细胞总体增长可能确实有所增强。更关键的是，绿色报告信号里，epsA 的表达增强最明显，而 tapA 的变化相对弱得多。作者随后又把 GFP 信号分别用 OD600 或 构成型 RFP 做了归一化，试图把生长更多与单细胞表达更强这两件事区分开来。结果显示，如果按 OD600 归一化，三个报告子都看起来有一定升高，但最强的是 epsA。如果按 RFP 去归一化，那么最清楚的差异依旧主要落在 epsA 上，而且这个增强集中出现在大约 20 到 30 小时这个窗口。也就是说，表面活素似乎不是笼统地把所有生物膜基因都打开，而更偏向于推动 EPS 相关操纵子 的表达，至少在作者使用的这套条件下是这样。这部分结果很重要，因为它给出了一个更具体的解释。作者认为，表面活素之所以能加快 pellicle 形成，很可能是两件事叠加的结果。一件事是它可能改善了后期培养中的增长表现。另一件事是它更明确地提高了 eps 操纵子 的表达，也就是促进更多细胞更早开始生产胞外多糖。由于以前已有研究表明，EPS 生产者形成的小聚集体能加速液面生物膜的建立，所以这个机制是非常合理的。换句话说，表面活素可能既让细胞状态更适合上浮和聚集，也让它们更快进入造基质的程序。

文章讨论里还特别提到，过去不同研究之所以对表面活素作用得出不同结论，很可能和培养基、时间点和观察方式不同有关。以前有研究在非生物膜诱导条件下看到 surfactin 能促进某些基因表达，也有研究在 20 小时这个终点看不出 srfAA 缺失对 pellicle 有显著影响。作者这次通过连续成像，把整个 48 小时过程拉直来看，才把这种不是必需，但会明显提速的作用拆了出来。这个思路本身就是整篇文章很重要的贡献。

文章最后的结论为，表面活素不是枯草芽孢杆菌 pellicle 生物膜形成的绝对必需因子，但它能显著加快生物膜发育。在大多数天然分离菌株中，缺失表面活素会让液面生物膜出现时间延后，而外源补加表面活素又能把这个延迟明显拉回来。它起作用的方式，至少部分来自于增强后期生长以及提高 eps 操纵子的表达。因此，更准确地说，表面活素不是有没有生物膜的开关，而更像是生物膜启动和推进速度的调节器。