单细胞病毒标记技术（VT）高效锁定肠道低丰度活跃感染噬菌体

人类肠道微生物群落由极其复杂的细菌和主要由噬菌体构成的病毒组组成。肠道细菌失衡与多种人类疾病密切相关，尤其在炎症性肠病（IBD）的病理过程中，噬菌体群落的结构和丰度改变已得到广泛研究。然而，由于绝大多数肠道噬菌体无法在体外进行纯培养，且基因组多样性极高，导致目前对其介导的分子机制知之甚少。现有的常规宏病毒组测序方法无法直接建立噬菌体与其细菌宿主之间的特异性连接，且受到数量丰度偏差的影响，极易忽略样本中的低丰度未知病毒。普拉斯尼茨法卡氏菌（Faecalibacterium prausnitzii）作为肠道内重要的专性厌氧共生菌，在健康人群中具有抗炎效应，但在IBD患者中显著减少。因此，研究团队针对这一关键宿主菌，利用单细胞病毒标记技术突破了传统物理培养与生物信息学宿主预测的局限性，在单细胞水平上实现了对未培养及特定分离株噬菌体的高效抽样与表征。

结果解析

1. 病毒标记技术是传统病毒组测序的强有力补充

研究人员并行采用了四种方法来评估和比较针对人类肠道病毒组（尤其是法卡氏菌噬菌体）的解析效能。首先，他们将来自克罗恩病（CD）患者和健康对照（HHC）个体的19份粪便样本的病毒组数据分别协同组装为CD和HHC两个基准宏病毒组。随后，他们选取其中法卡氏菌丰度较高的健康样本（Sample HHC-1），进行了未培养微生物的病毒标记（UnVT）测序 ；同时对该样本中分选出的100个细菌细胞开展了不经病毒标记的单细胞扩增基因组（SAGs）测序。最后，研究人员利用纯培养的法卡氏菌分离株（F. prausnitzii strain 22）与外源混合病毒颗粒进行定向的病毒标记测序（FpVT）。对比结果表明，单细胞测序方案虽然在前期质控中由于宿主细菌DNA占主导而过滤了较多Read，但VT和SAG测序在每条Read的病毒序列产生效率上与传统宏病毒组测序相当，且其核心优势在于能够直接、明确地将噬菌体序列物理链接至其细菌宿主。

图1. 结合宏病毒组、UnVT、SAGs和FpVT的多维肠道病毒发现技术路线示意图

2. 病毒标记技术能高效抽样稀有的噬菌体多样性

为了在不同测序深度和过滤策略下进行客观比较，研究人员对数据进行了标准化和归一化丰度分析。全基因组聚类分析显示，通过不同方法捕获的病毒群体和病毒操作分类单元（vOTU）几乎不存在重叠。在组装出的3,619个vOTUs中，无一为四种方法所共有。定量分析进一步证实，单细胞测序方法（特别是UnVT）在归一化后的病毒丰富度上显著高于其他方法。更为重要的是，当将常规宏病毒组测序的reads回帖到通过单细胞VT方案组装出的contigs上时，其覆盖度极低，这表明利用病毒标记技术捕获的大多数噬菌体在天然样本中的丰度极低，已超出了常规宏病毒组测序的最低检测限，证明了VT技术在挖掘稀有病毒组分方面的高灵敏度。

图2. 四种测序方案在稀释标准化下的噬菌体捕获效率与多样性抽样稀疏曲线对比 

3. 未培养病毒标记捕获到了罕见且高度多样化的噬菌体

在UnVT实验中，54个病毒阳性的单细胞共产生331个长度$\ge1\text{ kb}$的病毒contigs，其宿主横跨21个细菌属、10个科、8个纲和6个门。在这些病毒序列中，仅有1条contig与已知噬菌体具有序列相似性，其余均为首次发现。生活史预测显示，UnVT不仅能捕捉到含有溶源性标记基因的溶源噬菌体（7.3%）和整合的原噬菌体（3.3%），还捕获了大量可能表现为严格裂解性生活史的未知噬菌体。其中，法卡氏菌噬菌体UnVT_Faecalibacterium_19与已知的法卡氏菌溶源噬菌体Toutatis表现出显著的局部核苷酸和氨基酸同源性，并保守含有与多样性调节反转录转座子相关的avd基因和Hoc-like头部外壳蛋白基因。宏病毒组回帖分析显示，多达265个UnVT vOTUs在任何受试个体的常规宏病毒组中均无法被检测到，提示这些噬菌体属于高特异性且极低丰度的组分。

图3. 基于同一健康人类粪便样本的UnVT与SAG低丰度新颖噬菌体谱系及基因组图谱解析

4. 培养宿主的病毒标记技术鉴别出全新的噬菌体类型和活跃的感染事件

利用完全组装的普拉斯尼茨法卡氏菌strain 22作为已知宿主背景，研究团队进行了定向的FpVT测序。通过精确扣除宿主自身的内源性原噬菌体及背景序列，最终筛选出39条来源于外源吸附或感染的病毒contigs。分类学预测显示，除了常规的长尾病毒类群外，FpVT还首次在法卡氏菌中鉴别出5个丝状病毒（Tubulavirales，包含4个Inoviridae科成员）。此外，研究人员在两个独立的宿主单细胞中，直接观测到了两个新近自发整合进宿主染色体非原噬菌体区域的活跃原噬菌体contigs（FpVT_15和 FpVT_26）。这两条序列在其预测的病毒区间与宿主第4号内源原噬菌体相似，但两侧接有与宿主染色体$100%$一致的非侧翼序列，且其特异性核心attachment（att）整合位点清晰可见。这一结果直接从分子生物学水平证实了病毒标记技术捕获活跃的噬菌体感染及溶源化事件的能力。

图4. 普拉斯尼茨法卡氏菌新型丝状噬菌体发现及活跃原噬菌体自发溶源化整合位点分析

5. 单细胞测序方法能够有效富集并发现与炎症性肠病密切相关的噬菌体

为了探究这些低丰度新病毒的临床相关性，研究团队将VT鉴定的vOTUs回帖至包含37名CD患者、66名溃疡性结肠炎（UC）患者和66名健康对照的深度宏病毒组队列数据中。尽管超过半数（58.5%）的VT vOTUs在所有公共队列中均无法被检出，但通过Fisher精确检验和Tukey多重比较，研究人员仍成功锁定了5个与特定疾病状态具有显著丰度差异的关键病毒contigs。例如，源自法卡氏菌宿主的UnVT_Faecalibacterium_11和FpVT_28在CD样本中的检出率和丰度显著高于健康对照组 ；而整合于瘤胃球菌的原噬菌体UnVT_Ruminococcus_E_32则表现出与健康状态的强正相关。这表明，即使在宏病毒组群体水平上处于极低丰度，这些通过VT富集到的噬菌体成员同样可能在肠道炎症发生或稳态维持中发挥关键的生态学作用。

图5. 病毒标记噬菌体在临床队列中的丰度分布及其与炎症性肠病（IBD）的显性关联表征 

结论

该研究有力地确立了单细胞病毒标记（VT）技术在解析复杂肠道宏病毒组和规避丰度偏好性方面的技术优势。通过该方案，研究人员成功拓展了人体罕见肠道病毒的多样性图谱，并鉴别出了数个与炎症性肠病（IBD）紧密相关的特定低丰度噬菌体指标。更重要的是，研究首次在分子水平上证实了普拉斯尼茨法卡氏菌受新型丝状病毒感染以及发生自发溶源化整合的生物学事实。这些低丰度噬菌体因子的成功发现，不仅为深入理解IBD病理微生态提供了全新视角，也为未来针对肠道重大慢性疾病开展精准的噬菌体工程化调控与个性化微生态诊疗奠定了坚实的科学基础。