Biofilm：钩端螺旋体在接近宿主体温时，不但能长，还更容易形成更厚的生物膜

作为模型菌的钩端螺旋体，在更接近宿主体温的条件下，不仅活得不错，还更愿意在表面搭起一层更厚、更持久的“保护膜”。而这层膜里面，最重要的“胶”和“支架”之一，很可能就是蛋白。

钩端螺旋体这个属里既有致病种，也有非致病种，它们是形态很特别的螺旋形细菌。致病种会引起钩端螺旋体病，这是一种全球范围内都很重要的人兽共患病。过去人们已经知道，钩端螺旋体不仅能以游离细胞的方式存在，也能形成生物膜，而且这种生物膜不只在体外培养时能看到，在自然环境里，比如稻田、卫生条件差的城市环境中也能发现，甚至在大鼠肾脏这种体内定殖部位也能观察到。正因为如此，作者想进一步追问一个很关键的问题：如果把温度提高到更接近宿主感染时会遇到的条件，也就是 37 摄氏度加 5% CO₂，钩端螺旋体的生长和生物膜形成会发生什么变化。

过去绝大多数关于钩端螺旋体生物膜的研究，基本都是在 28 到 30 摄氏度这样的传统培养条件下做的，常用培养基是 EMJH 或类似体系。可是真正的感染环境并不是这个温度。比如大鼠肾脏中的温度大约就在 36 到 38 摄氏度，而且现在新发展的 HAN 培养基 已经能够支持钩端螺旋体在 37 摄氏度 下生长，所以作者认为，是时候把“宿主样温度”纳入生物膜研究框架了。文章选择的对象是 Leptospira biflexa，也就是一种非致病、但常被当成整个属模型菌的腐生钩端螺旋体。之所以选它，是因为它长得比较快、不致病、容易操作，而且在生物膜形成能力和一些潜在相关基因上，与致病钩端螺旋体有相通之处。

在方法上，这篇文章做了几条互相补充的分析线。作者先让 L. biflexa Patoc 1 在 HAN 液体培养基中分别于 29 摄氏度 和 37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下培养，看游离状态的生长曲线。然后他们把玻璃载玻片插入锥形管中，让细菌在玻璃表面形成附着生物膜。接着，他们用 结晶紫染色 做一个相对传统的半定量，追踪第 4 天到第 14 天的生物膜量变化。为了更准确地看生物膜的结构和组成，他们又用 共聚焦显微镜 配合两种染料，一种是 Sypro Ruby，用来看生物膜基质蛋白，一种是 DAPI，用来看双链 DNA。这里的 DAPI 不只会标记活细胞和死细胞里的 DNA，也会标记胞外 DNA。之后，作者还做了 透射电镜负染，分别用能更突出蛋白的 磷钨酸 和能更突出酸性黏多糖的 钌红 去看成熟生物膜的超微结构。最后，他们还把浮游细胞、中间态细胞和成熟生物膜收集起来，做了一维胶电泳和免疫印迹，看看在不同温度下蛋白表达有没有可见差别。

文章最先得到的一个结果是，L. biflexa 在 HAN 培养基里，无论 29 摄氏度还是 37 摄氏度加 5% CO₂，都能以相似速度生长。也就是说，温度升高到接近宿主感染条件，并没有把这种模型钩端螺旋体“养不起来”。但作者马上发现了一个很有意思的变化，就是细胞长度明显变了。在 29 摄氏度 下生长的游离细胞，平均长度大约是 13.93 ± 2.84 微米，中位数约 12.93 微米；而在 37 摄氏度加 5% CO₂ 下，平均长度上升到 18.52 ± 3.39 微米，中位数约 18.67 微米。也就是说，温度升高并没有改变总体生长曲线，却让细胞本身显著变长了。作者认为，这提示高温条件下细胞生理状态或代谢方式已经发生了调整。接下来是生物膜形成本身。作者看到，L. biflexa 在两种温度下都能在玻璃表面形成明显的白色附着膜，而且在液面交界处会更厚一些。用结晶紫跟踪后发现，两种条件下的生物膜都从 第 4 天开始进入成熟阶段。但更高温度下的生物膜在多个时间点更厚。具体来说，在 第 8、11 和 14 天，37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下的结晶紫信号显著高于 29 摄氏度，说明总体生物膜量更大。还有一个时间上的差异也很关键。29 摄氏度下，生物膜的脱落大约在第 11 天开始；而 37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下，脱落要到 第 14 天 才明显出现。换句话说，在更接近感染环境的温度下，生物膜不只更厚，而且持续时间更长。

为了避免只靠结晶紫这一种方法下结论，作者又用共聚焦显微镜做了更细的分析。这里出现了一个很值得注意的细节。把 Sypro Ruby 和 DAPI 两个通道的信号合起来看，总体生物膜生物量在两种温度间并没有始终表现出显著差异，特别是在作者重点比较的 第 7 天，两种条件下的总生物量基本相当。这也正是作者后面拿去做蛋白分析的重要时间点。这个结果其实说明，结晶紫和共聚焦反映的是不同层面的信息。结晶紫更容易受整体染色和洗涤步骤影响，而共聚焦更能拆开不同基质成分来看，所以两者不能简单互相替代。

这层生物膜到底是由什么堆起来的？结果很清楚，蛋白是一个非常重要、而且比双链 DNA 更突出的基质成分。无论在 29 摄氏度还是 37 摄氏度加 5% CO₂，Sypro Ruby 检测到的蛋白质生物量在多个关键时间点都显著高于 DAPI 检测到的 dsDNA 生物量。具体来看，在 29 摄氏度 下，这种差异在 第 8 和第 9 天 最明显；在 37 摄氏度加 5% CO₂ 下，则在 第 7、8 和 9 天 都很明显。作者因此认为，对 L. biflexa 来说，生物膜基质并不是以 DNA 为主，而是蛋白占有更核心的位置。

共聚焦三维重建还显示，这种蛋白不是随便分散在整个膜里，而是形成了非常有特点的空间结构。作者在 XYZ 方向上看到，生物膜有明显的“山丘和谷地”式不均匀三维结构。更重要的是，在靠近玻璃底部的位置，有一层非常清晰、连续的蛋白层贴附在固体表面上。这一层在 29 摄氏度 和 37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下都能看到，而且从附着期、成熟期到脱落期都存在。作者据此提出，这层蛋白很可能在细胞和固体表面的黏附中起到了关键作用。除此之外，蛋白还分布在 dsDNA 之间，像支架一样给整个三维结构提供支持。也就是说，蛋白在这里很可能既负责“粘住底部”，又负责“撑起整体”。透射电镜结果进一步支持了这一点。无论在 29 摄氏度还是 37 摄氏度加 5% CO₂，成熟期生物膜都表现为致密而复杂的网络状结构，里面有微生物细胞，也有明显的胞外基质和一些空隙。用 磷钨酸 染色时，可以看到与蛋白相关的结构，还观察到一些囊泡样结构和类似鞭毛的结构。用 钌红 染色时，则能看到酸性黏多糖形成的无定形基质，从较稀疏到较致密的状态都有。作者因此认为，L. biflexa 生物膜的基质并不是单一成分，而是至少包括蛋白、DNA 和酸性黏多糖。不过从共聚焦定量上看，蛋白在这个体系里显得尤其重要。

文章还做了蛋白提取和一维电泳，作者证明，用玻璃载玻片加 HAN 培养基的这套体系，确实能得到足够多的成熟生物膜蛋白，并且条带分辨率很好，蛋白大小从 小于 20 kDa 到大于 220 kDa 都有。更进一步，他们还做了一个针对 GroEL 的免疫印迹。GroEL 是一个 60 kDa 的热休克蛋白家族成员。结果显示，在 37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下形成的生物膜中，GroEL 的表达看起来高于 29 摄氏度下的生物膜。作者没有把这一步夸大成完整蛋白组学结论，但它很明确地说明，这套模型已经能够支持后续去真正比较不同温度、不同表型下的蛋白表达差异。

这篇文章最后的结论为，L. biflexa 不仅能在传统的 29 摄氏度条件下形成生物膜，也能在接近宿主感染环境的 37 摄氏度加 5% CO₂ 条件下形成生物膜，而且后者通常更厚、持续更久。与此同时，这种生物膜的基质中，蛋白比双链 DNA 更突出，而且在固体表面存在一层非常稳定的蛋白底层，这提示蛋白在生物膜对无生命表面的附着和整体结构维持中发挥了关键作用。作者还强调，他们建立的玻璃载玻片加 HAN 培养基模型，克服了一些传统方法的局限，能提供足够材料去开展深入蛋白组学研究，这对今后找出生物膜关键蛋白成分很有价值。