NOVAsort赋能液滴微流控高准确无误分选

NOVAsort赋能液滴微流控高准确无误分选

液滴微流控被广泛认为是单细胞分析、定向进化、蛋白质工程、微生物筛选和高通量功能筛选的重要技术平台。该技术能够将单个细胞、分子或反应体系封装在微小液滴中，使每个液滴成为独立微反应器，从而实现百万级规模的快速筛选。然而，在真实多步骤液滴实验中，液滴经常会经历培养、热循环、融合、再注入等过程，导致液滴发生意外融合或破裂，形成尺寸不均一的多分散液滴群。这种液滴尺寸多分散性会显著降低传统液滴分选器的准确率，造成大量假阳性和假阴性结果。

近期，国际期刊《Nature Communications》发表了题为“NOVAsort for error-free droplet microfluidics”的研究论文。研究团队提出了一种新型液滴分选系统NOVAsort，全称为Next-generation Opto-Volume-based Accurate droplet sorter，即“下一代基于光学与体积信息的高准确液滴分选器”。该系统不仅依据荧光信号识别目标液滴，还能够根据液滴尺寸进行筛选，从而在多分散液滴样本中准确分离出尺寸正确且荧光阳性的目标液滴。研究显示，NOVAsort可将假阳性和假阴性分别降低约1000倍和10000倍，在多分散液滴库中仍可实现超过99%的分选准确率，并在体外转录/翻译（IVTT）液滴筛选流程中显著提升目标液滴富集效果。

NOVAsort：面向复杂液滴体系的高准确分选新方案

液滴微流控的核心优势在于高通量和单液滴分辨率。每个液滴可作为独立反应单元，用于单细胞培养、酶活筛选、抗体发现、核酸扩增、蛋白质表达和微生物功能分析等任务。然而，传统液滴分选通常只依据单一信号，例如荧光强度、颜色变化或阻抗信号判断液滴是否为目标液滴。一旦液滴尺寸发生异常，传统方法就很难区分真正目标液滴与由液滴融合或破裂产生的错误液滴。

例如，在百万级液滴筛选中，即使只有1%的分选错误，也会产生约10000个错误结果，这会给后续培养、测序、验证和功能分析带来巨大负担。尤其是在多步骤实验中，液滴经历长时间孵育、高温热循环或液滴融合操作后，尺寸不均一几乎不可避免。传统依赖荧光强度的分选方式难以处理这类复杂样本。

NOVAsort的核心思想是：只有同时满足“尺寸正确”和“荧光阳性”两个条件的液滴，才被判定为真正目标液滴并进入目标出口。

该系统利用水相液滴在油相中的自然浮力，以及位于微流道底部的平面叉指电极（interdigitated electrodes, IDEs）产生的局部介电泳力，实现基于液滴体积/尺寸的物理筛选。较大的液滴更接近底部电极，因此会受到较强介电泳力作用；较小液滴因浮力作用远离电极，受到的介电泳力较弱，难以被偏转。通过精确设计通道高度和电极位置，NOVAsort能够选择性操控特定尺寸范围内的液滴。

尺寸筛选与荧光识别协同提升分选准确率

NOVAsort芯片主要由四个功能区域构成。第一部分是液滴间隔与抬升区。该区域通过侧向间隔油流调节液滴间距，同时利用通道高度差和油相鞘流将液滴抬升至通道顶部，为后续尺寸筛选创造稳定流动状态。第二部分是大液滴去除区。这里设置第一组IDE电极，功能类似“低通筛选器”，能够将尺寸过大的液滴导入废液出口。过大液滴通常来自液滴意外融合，可能包含多个细胞或过量反应试剂，容易造成假阳性，因此需要提前去除。第三部分是重新聚焦与下压区。在该区域，通道高度由较高变为较低，使液滴重新靠近底部电极，同时通过流体聚焦将液滴导向合适位置，为最终分选做好准备。第四部分是目标液滴分选区。荧光检测激光聚焦在第二组IDE电极前方，当液滴荧光强度超过设定阈值时，系统触发IDE电极产生局部介电泳力。由于该电场只对尺寸合适且靠近电极的液滴有效，因此只有尺寸正确、荧光阳性的液滴会被导入目标出口；小液滴或荧光阴性液滴则进入废液出口。与传统线性液滴分选器相比，NOVAsort的突出特点在于其局部电场和导轨式分选路径。传统分选器通常使用液态金属三维电极，从侧向突然拉动液滴，容易造成相邻液滴误拉、液滴融合或液滴撕裂。而NOVAsort的IDE电极位于流道底部，产生局限于电极附近的电场，并像“导轨”一样温和地引导液滴偏转，从而显著减少误分选和液滴损伤。

图1 NOVAsort的设计^[1]

多分散液滴库中实现高准确目标液滴富集

研究团队首先构建了包含三种尺寸液滴的模型体系，包括小液滴、目标尺寸液滴和大液滴，并设置荧光阳性与荧光阴性液滴混合输入。实验结果显示，NOVAsort能够将大液滴导入第一个废液出口，将小液滴和荧光阴性液滴导入第二个废液出口，仅将目标尺寸且荧光阳性的液滴导入目标出口。整体分选准确率超过99%。

随后，研究人员将NOVAsort与传统线性分选器进行对比。在高度多分散液滴库中，传统线性分选器的目标液滴富集效果有限，仅能将目标液滴比例从约3.6%提升至23.6%。相比之下，NOVAsort可将目标液滴比例从约5.8%提升至98.8%，显示出对复杂多分散样本的强大鲁棒性。

该研究还测试了负向分选场景。负向分选是指从大量荧光阳性液滴中筛选少量荧光阴性液滴，例如筛选能够抑制细胞生长、抑制荧光报告表达或产生毒性效应的样本。这类实验中，传统分选器需要频繁触发电场，容易引起多液滴误拉或液滴融合。实验显示，NOVAsort在负向分选中的错误率显著低于传统线性分选器，表现出更高的稳定性和应用潜力。

局部电场降低液滴融合与撕裂风险

传统介电泳液滴分选器在高通量条件下常面临两个问题：一是相邻液滴因电场范围过大而被同时拉动，产生假阳性；二是液滴在强电场和流体剪切力共同作用下被撕裂，尤其是大尺寸液滴更容易出现破裂。

NOVAsort通过底部IDE电极产生高度局部化的电场，只影响位于电极正上方的液滴，因此即使液滴间距较小，也不容易发生多液滴误分选。实验显示，当液滴间距从1600 μm缩短至200 μm时，传统线性分选器准确率从97.4%急剧下降至16.8%；而NOVAsort在相同条件下仍能保持约96.6%的准确率。

此外，NOVAsort的工作电压显著低于传统分选器。在低通量条件下，NOVAsort仅需约20 Vpp即可工作，而传统线性分选器可能需要约600 Vpp。在更高通量条件下，NOVAsort所需电压仍远低于传统方案。低电压不仅提高了系统安全性，也降低了液滴破裂、融合以及生物样本损伤的风险。

IVTT液滴筛选验证真实应用价值

为了验证NOVAsort在实际生物化学流程中的应用价值，研究团队将其用于液滴内体外转录/翻译（IVTT）筛选。IVTT可在无细胞体系中快速合成蛋白质，是蛋白质工程、合成生物学和定向进化的重要工具。然而，IVTT液滴流程通常包括DNA模板封装、液滴PCR热循环、液滴融合和蛋白表达等步骤，其中热循环和融合操作极易造成液滴破裂、收缩、融合或过度融合，导致最终液滴库高度多分散。

在该实验中，研究人员首先生成单DNA模板液滴，并通过热循环扩增DNA；随后将其与含IVTT试剂的液滴融合，在液滴内表达绿色荧光蛋白GFP。由于热循环和融合过程带来明显液滴尺寸不均一，传统分选器难以准确筛选真正目标液滴。

结果显示，在未分选输入液滴中，仅约27.2%液滴同时具备正确尺寸和GFP阳性信号。传统线性分选器分选后，目标液滴比例仅提升至43.8%。而NOVAsort分选后，正确尺寸且GFP阳性的目标液滴比例达到95.3%，使IVTT液滴筛选效率提高约217%。这一结果表明，NOVAsort不仅适用于模型液滴体系，也能够应对真实复杂实验流程中的多分散液滴问题。

产业化与广泛应用仍需突破关键环节

尽管NOVAsort在准确率、低电压和多分散液滴兼容性方面表现突出，但要进一步推广到更广泛的生物筛选和产业应用，还需要解决若干问题。首先，不同应用场景中的目标液滴尺寸不同，NOVAsort的尺寸筛选能力与通道高度、液滴直径、电极位置和油水相密度差密切相关。因此，针对不同液滴体系，需要定制化设计芯片结构。其次，NOVAsort芯片制造工艺相对复杂。该研究使用双光子聚合技术制备具有平滑高度过渡结构的主模，并采用Ti/Au平面叉指电极及Si₃N₄钝化层。这些工艺提升了器件性能和稳定性，但也增加了制造门槛和成本。第三，电极钝化层厚度需要在器件寿命和操作电压之间权衡。较厚的Si₃N₄钝化层有利于保护电极并支持长时间运行，但也会提高所需驱动电压。第四，在极端拥挤液滴体系中，若小的荧光液滴与正确尺寸的非目标液滴非常接近或接触，仍可能导致非目标液滴被误分选。因此，后续仍需优化液滴间距控制、流速调节和实时检测算法。总体来看，NOVAsort将液滴尺寸信息引入传统荧光激活液滴分选流程，解决了多步骤液滴实验中长期存在的多分散样本误分选问题，为液滴微流控从理想单分散体系走向真实复杂筛选体系提供了关键技术支撑。

参考文献：

[1] Zhang H, Gupte R, Li Y, Huang C, Guzman A R, Han J J, Jung H, Sabnis R, de Figueiredo P, Han A. NOVAsort for error-free droplet microfluidics. Nature Communications. 2024;15:9444. https://doi.org/10.1038/s41467-024-52932-z