无需培养、60分钟完成检测！新型CRISPR-Cas12a“DNA行走”技术实现MRSA超灵敏识别

近日，《Journal of Microbiology and Biotechnology》刊登了一项关于MRSA快速检测的研究。研究人员没有直接去检测细菌核酸，而是把目光放到了MRSA表面的PBP2a蛋白上。他们用适配体识别PBP2a，再利用一个可切换结构的探针控制CRISPR-Cas12a，配合DNA聚合酶进行信号放大。实验结果显示，该方法的检测限为2.5 CFU/mL，研究中采用的检测时间为60 min。

从“检测DNA”转向识别细菌表面蛋白

Cas12a本身是一种核酸酶。按照常见的CRISPR检测思路，Cas12a/crRNA识别目标DNA后会被激活，并产生trans-cleavage活性，进而切割体系中的报告探针并产生荧光信号。这项研究的不同之处在于，Cas12a并没有直接去“找”MRSA的核酸。研究人员设计了一个Locker-probe，把针对PBP2a的适配体和抑制Cas12a活性的序列放在同一个结构中。没有MRSA时，Locker-probe处于原来的结构状态，Cas12a受到抑制；加入MRSA后，适配体与PBP2a结合，探针结构随之发生变化，Cas12a的抑制状态被解除。随后，Cas12a进入反应过程并产生荧光信号。因此，这套体系实际上绕开了“先提取目标核酸、再激活Cas12a”的常见路径，把PBP2a蛋白识别和Cas12a信号输出接到了一起。

DNA Walker参与循环，进一步放大检测信号

为了把信号做得更明显，研究人员又加入了DNA聚合酶介导的延伸过程。PBP2a与适配体结合后，会暴露出可以参与后续反应的DNA区域。引物结合后，聚合酶开始延伸，随着反应继续进行，目标又可以从原来的结合状态中释放出来，重新参与下一轮识别。这样的循环能够让同一个目标参与多轮反应，进而增加Cas12a被激活的机会。研究人员把这一过程用于DNA Walker式的信号放大，以提高体系对低浓度MRSA的响应。论文中还将Cas12a的cis-cleavage和trans-cleavage相关过程放在同一检测体系中，减少了探针设计上的重复设置。

图1 基于可编程CRISPR/Cas12a的生物传感方法的工作原理^[1]

检测限达到2.5 CFU/mL，实验条件下60分钟完成反应

研究人员随后测试了不同浓度的MRSA。结果显示，在10～10⁶ CFU/mL范围内，荧光强度随菌浓度增加而升高，所得标准曲线的R²为0.9954。按照S/N=3计算，检测限为2.5 CFU/mL。反应时间方面，论文将60 min作为优化后的检测条件。30 min时信号还在增加，延长至60 min后继续观察，90 min时的变化已经不明显，因此后续实验采用60 min作为反应时间。

多种菌株对照，只有MRSA出现明显响应

研究人员还拿几种常见菌株做了对照，包括MRSA、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌。在相同浓度下，MRSA组出现了明显的荧光变化，而其他菌株的信号变化较小。论文认为，这与PBP2a适配体的识别以及Cas12a体系的序列特异性有关。

模拟血清实验结果较好，真实临床样本仍是下一步

研究人员还做了模拟血清实验，并把检测结果与传统平板计数法进行了比较。两种方法的相关系数达到0.9934；构建血清样品中的加标回收率为97.3%～104.3%。不过，这部分实验用的是人工构建的血清样品，而不是患者的真实临床样本。论文作者对此也作了说明，认为后续还需要通过真实临床样本进一步验证方法的适用性。

快速检测离实际应用，还有几步要走

这项工作的一个看点，是把原本用于核酸检测的Cas12a接到了PBP2a蛋白识别上。不过，从实验室方法走到实际检测产品，中间还有不少工作要做。真实临床样本、样本前处理、设备适配和检测成本等问题，都需要进一步解决。

与此同时，微生物快速检测在食品安全领域已经有较成熟的产品基础。国内一些企业已经围绕常见食源性致病菌推出快速检测产品和相关服务。以广州环凯微生物科技有限公司为例，公司已有针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等微生物的快速检测产品，可用于食品生产、流通和质量控制等环节。公司同时开展相关微生物检测服务，为食品企业提供检测及报告服务，帮助企业进行产品质量评价和食品安全风险控制。这类成熟的检测产品，与论文中正在探索的CRISPR检测技术并不是同一条路线。前者已经进入实际应用，后者则更多处在方法研究和性能验证阶段。随着新技术不断完善，两者未来能否在不同检测场景中形成互补，仍值得继续关注。

这项研究值得关注的地方

把整套方法拆开来看，思路其实比较清楚：PBP2a适配体负责找到MRSA，Locker-probe负责控制Cas12a，DNA聚合酶负责延伸和循环，Cas12a最后把这些变化转换成荧光信号。对于CRISPR检测而言，这种设计提供了一个值得关注的方向——目标不一定非要是一段核酸，也可以先通过适配体识别蛋白，再把识别结果交给CRISPR体系放大。不过，目前的研究仍停留在实验验证阶段，真实临床样本和更大规模的应用测试还没有展开。因此，与其把它看成一种已经成熟的MRSA临床检测产品，不如把它理解为一种新的检测方案：它证明了适配体和Cas12a可以被组合起来，用于识别完整细菌相关的蛋白标志物，也为后续进一步优化MRSA以及其他病原菌的快速检测提供了实验基础。

参考文献

[1] Xiao B, Zhang J. A Simple Programmable Cas12a/crRNA Induced Walking System for Sensitive Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Detection via Integrated cis- and trans-Cleavage Activity. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2026;36:e2511026.