探索草莓中磁珠捕获提高人类诺如病毒的检测

原创

来源：薛亮

2024-04-25 11:30:35

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核心提示：人类诺如病毒(HuNoVs)是世界范围内食源性疾病的主要原因，由于难以洗脱和富集微量病毒颗粒，在食品中检测HuNoVs仍然是一项挑战。

人类诺如病毒(HuNoVs)是世界范围内食源性疾病的主要原因，由于难以洗脱和富集微量病毒颗粒，在食品中检测HuNoVs仍然是一项挑战。本研究开发了猪胃黏液标记磁捕获探针，并在前人研究的基础上优化了其与HuNoVs结合、病毒颗粒洗脱和RNA分离的条件。采用反转录定量PCR (RT-qPCR)技术对人工污染草莓样品的磁捕获预处理方法进行了评价，并与传统聚乙二醇沉淀法进行了比较。

结果表明，Tris⋅HCl (pH 9.5)是磁探针与病毒颗粒结合的最佳缓冲液，加热释放获得的RNA回收率显著高于商用试剂盒，且仅捕获活性病毒。该缓冲液与RT-qPCR缓冲液相似，提高了RT-qPCR的敏感性。此外，在以往的研究中，该缓冲液是一种从食品中洗脱病毒颗粒的有效溶液，并对其进行了优化，以确保最大程度的洗脱，而对病毒捕获没有抑制作用。作者探索了多种因素或步骤，以确保该方法的灵敏度比传统方法高三个数量级。研究结果表明，基于磁捕获的检测方法对HuNoVs的敏感检测具有很大的潜力。

图1 磁捕获法检测草莓中HuNoVs的示意图

为了确定最佳的捕获缓冲，选择了几种缓冲进行对比实验。在不同的缓冲液中孵育后，用磁铁收集磁性颗粒，通过加热从磁性探针-病毒颗粒复合物中分离RNA。离心后，得到的上清用作RNA模板，进行RT-qPCR检测。

RT-qPCR结果(表1)表明，磁性探针在较高pH值的缓冲液中捕获了更多的病毒颗粒(GII.2)。10 mmol/L Tris⋅HCl (pH 9.5)缓冲液的吸附效果最佳(n = 3, p < 0.05)。为了计算和比较相对回收率，作者根据Ct值和标准曲线(y = 2.659x + 20.262)确定最高组为100%，标准曲线是用梯度稀释10倍的病毒溶液生成的。作者注意到，在酸性条件下和较高的pH值，如pH 11.4，病毒颗粒不能使用磁性探针回收。

表1 GII.2HuNoVs在不同缓冲液中的磁捕获

注释：No表示没有积极信号;“\”表示不能计算结果，因为没有正信号或没有数据。

缩写:CBS，柠檬酸盐缓冲盐水;MES, 2-(N-morpholino)乙磺酸;PBS，磷酸盐缓冲盐水。

由于基于加热的策略分离的RNA存在粗RNA以及潜在的蛋白质或其他生物分子的结合，不确定是否适合逆转录。为了解决这一问题，作者使用了三种不同类型的引物(oligo d(T)引物、随机六聚体引物和通常用于HuNoVs测序和鉴定的特异性引物)对粗RNA进行逆转录，然后通过PCR扩增cDNA。

结果(图2)表明，从作者基于加热的策略分离的粗RNA中获得cDNA需要特定的引物，琼脂糖凝胶中存在PCR产物(327 bp)。相反，当使用商业试剂盒分离RNA时，采用三种引物的反应中存在所有PCR产物。使用oligo d(T)引物和随机引物的逆转录过程靶向整个基因组RNA (7.3-7.7 kb)，而特定引物仅靶向327 nt序列。对于特别长的基因组RNA，由于作者基于加热策略分离的RNA序列与杂质分子结合，可能会在前两种情况下发生早期终止。然而，由于较短的靶RNA序列(327 nt)和目标区域中存在杂质分子的可能性降低，特异性引物的使用显著降低了早期终止的可能性。此外，作者通过RT-qPCR对HuNoVs样本进行检测，其所需的靶序列长度始终小于100 nt(如本研究中检测HuNoVsGII的条形码序列仅为98 nt)，进一步减少了杂质分子结合带来的抑制作用。

图2 以低聚d(T)引物(a)、随机六聚体引物(b)和特异性引物(c)反转录cDNA为模板的PCR产物(M: DNA标记物;m + h:通过磁捕获和加热策略分离粗RNA;试剂盒:用试剂盒分离RNA;NC:无cDNA的阴性对照)

前面的实验已经证明，使用加热策略分离的粗RNA可以用于特定引物的逆转录。然而，目前尚不清楚分离率是否足以进行RT-qPCR检测。因此，作者将他们的策略与商业试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit，Qiagen，德国)进行了比较，该试剂盒被广泛报道对HuNoVs具有优越的RNA分离能力。从感染HuNoVs GII.2的患者身上收集病毒样本(粪便)，在12,000 rpm下离心10分钟后，用碱性缓冲液(10 mmol/L Tris⋅HCl, pH 9.5)连续稀释10倍。采用加热策略从稀释103至108倍的溶液中分离RNA，然后进行RT-qPCR。

RT-qPCR结果(图3)表明，作者的磁捕获和加热策略优于商业试剂盒，在相同浓度下具有更高的回收率(更低的Ct)，检测限提高了一个数量级(10倍)。此外，除了上面提到的，作者的战略还有其他几个优势。

商业试剂盒只能处理有限体积的样品，即140 µL。虽然第一步可以处理额外的140 µL，但两种产品仍然有限。相比之下，作者的策略可以处理高达50 mL甚至更多的样品体积。