一种同位素稀释质谱测定法，追踪疫苗加工中间体中的诺如病毒样颗粒

  冠状病毒病(COVID-19)大流行表明疫苗开发的速度加快，这凸显了在生产和纯化过程中需要更快速、更有效的分析方法来跟踪和表征候选疫苗。这项工作中的候选疫苗包括植物来源的诺如病毒样颗粒(NVLP)，这些颗粒是模仿病毒但缺乏任何传染性遗传物质的结构。这里介绍的是一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，用于定量病毒蛋白VP1，这是本研究中NVLP的主要成分。它将同位素稀释质谱(IDMS)与多反应监测(MRM)相结合，以定量工艺中间体中的靶肽。在不同的MS源条件和碰撞能量下测试了VP1肽的多个MRM通道(母离子/子离子对)。用于定量的最终参数选择包括三种肽，具有两个MRM通道，每个肽在优化的MS条件下提供最大的检测灵敏度。为了定量，将待定量肽的同位素标记版本的已知浓度加入工作标准溶液中以用作内标(IS);生成天然肽浓度与天然同位素标记肽峰面积比的校准曲线。样品中的VP1肽使用与标准品相同水平的标记版本的肽进行定量。对肽进行定量，检测限(LOD)低至1.0 fmol μL−1定量限(LOQ)低至2.5 fmol μL−1。在NVLP制剂中加入已知数量的天然肽或包含组装的NVLP的原料药(DS)，产生的回收率表明基质效应最小[1]。

  图一 测定法追踪过程

  在这项工作中，NVLP经历了一系列纯化步骤，从上游的粗提取物到下游高度纯化的形式，即原料药(DS)。为了支持工艺开发，有必要准确且可重复地量化和跟踪纯化过程不同阶段存在的VP1量。由于每个样品中的基质效应，开发各种工艺中间体的定量分析可能会带来挑战。此外，在早期步骤中间体中，在存在高浓度宿主细胞蛋白的情况下，该测定必须能够检测少量的目标蛋白。

  LC-MS/MS是一种准确、快速、灵敏的肽和蛋白质定量方法，本文报道的方法用于定量NVLP制剂中的VP1。这种方法基于美国疾病控制与预防中心(CDC)制定的策略，用于量化流感疫苗和病毒制剂中的HA和神经氨酸酶(蛋白质抗原)。它将IDMS与MRM方法相结合，在LC-MS/MS分析之前对经过消化的疫苗制剂中的靶蛋白进行定量。定量基于对靶蛋白特有的肽的检测，假设完全消化，则与它所来源的蛋白质以化学计量比存在。在此，成功地调整和扩展了这种方法，以通过DS纯化的不同阶段来量化和跟踪NVLP制剂中的VP1;这种方法最终使用IDMS对候选疫苗和治疗药物中的蛋白质进行量化。

  总体而言，本文报告了一种快速、特异性、选择性和灵敏的LC-MS/MS策略，通过诺如病毒候选疫苗DS的纯化步骤来追踪NVLP。据我们所知，这是IDMS方法首次应用于跟踪植物中产生的病毒样颗粒(VLP)以及使用VP1(一种诺如病毒衣壳蛋白)进行的测量。

  参考文献：

  [1] Jhingree J.R., Boisvert J., Mercier G. An isotope dilution mass spectrometry assay to track Norovirus-like particles in vaccine process intermediates by quantifying capsid protein VP1 [J]. Anal Methods, 2023, 15(22): 2729-2735