诺如病毒衣壳蛋白氨基酸替换决定宿主传播的机制

  国际权威病毒学杂志《Journal of Virology》发表了一项诺如病毒研究，以鼠源诺如病毒(MNV)为模型，研究病毒与受体相互作用的分子机制。揭示了主衣壳蛋白VP1 301氨基酸残基的突变对病毒与受体的相互作用有关键影响。

  先前的研究发现MNV VP1的21个氨基酸与受体CD300lf形成相互作用网络。通过对所有MNV序列的比对，发现大多数残基在MNV分离株中是高度保守。然而，一个残基VP1 301存在很大的变异性。从GenBank上保存的序列中绘制了MNV VP1 301的总体氨基酸变异(图1A)。对MNV-1的感染性克隆进行了修饰。CW1(编码VP1的氨基酸301处的T)编码I、缬氨酸(V)或脯氨酸(P)。为了确定该位置氨基酸的重要性，还生成了编码丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)或赖氨酸(K)的感染性克隆。S和L分别与T和I具有相似的生化特性，但R基团结构不同，因此我们选择了不同的氨基酸来研究特定氨基酸的相对重要性。天冬氨酸和赖氨酸则未在天然分离物的这个位置发现。

  将这些克隆用于产生体外转录RNA，并通过转染BHK-21细胞回收病毒。回收的病毒在MNV常见培养细胞系BV-2细胞(悬浮生长为BV-2S)和RAW 264.7细胞中连续传代10次(图1B,C)。从指定传代的病毒样本中提取RNA，进行逆转录，并确定基因组序列。结果在所有传代病毒中，除VP1 301位置发生氨基酸替换外，ORF1、ORF2、ORF3或ORF4均未检测到其他氨基酸变化。为了确定这些替换对病毒产量的影响，采用TCID50法评估BV-2S和RAW 264.7细胞传代实验的上清液的病毒滴度(图1D)。数据表明在VP1 301位点具有异亮氨酸的病毒在悬浮细胞培养中具有选择性优势。

  图1 MNV-1的传代导致VP1 301处疏水残基的选择

  在BV-2S和RAW 264.7细胞中，MNV-1 CW1 I301与MNV-1 CW1 T301相比均具有更多的附着(图2A,C)，RT-qPCR定量分析也验证了这一结果(图2B，D)。

  图2 MNV-1 CW1 I301在体外表现出更强的细胞附着

  如图3所示，WB和RT-qPCR严重发现与37℃相比，0℃的病毒附着显著降低，用干扰膜迁移的MβCD对细胞进行预处理，结果显著降低了病毒的附着，表明膜迁移率是MNV附着的重要因素。

  图3 膜流动性有助于MNV在体外的附着

  用3 × 105 PFU/小鼠灌胃MNV-1 CW1 I301，CW1 T301，感染7周龄C57BL/6小鼠。感染后12小时处死小鼠，收集组织，通过空肠、十二指肠、回肠、盲肠、脾脏和肠系膜淋巴结测定病毒滴度。与MNV-1相比，脾脏中CW1I301滴度明显升高。表明VP1中301位置的单氨基酸从T替换为I可以导致病毒在宿主体内传播发生变化。

  图4 VP1残基301是小鼠宿主内传播的决定因素

  进化研究表明，人源诺如病毒氨基酸突变在整个慢性感染期间不断积累，其中大多数位于VP1突出结构域。这些进化变化也与免疫逃避有关，导致了病毒抗原表位的变化。然而，利用病毒样颗粒和生物信息学的数据在是否可以改变病毒与受体相互作用方面是矛盾的。根据该研究结果，该机制可能也被人源诺如病毒利用。随着目前的反向遗传系统的改进以及斑马鱼培养体系的建立，可以对人源诺如病毒传染性进行研究，进一步验证这一假设。

  参考文献：

  Mills JT, Minogue SC, Snowden JS, Arden WKC, Rowlands DJ, Stonehouse NJ, Wobus CE, Herod MR. Amino acid substitutions in norovirus VP1 dictate host dissemination via variations in cellular attachment. J Virol. 2023;97(12):e0171923. doi: 10.1128/jvi.01719-23