基于微流控的纳米等离子体放大技术实现病原体核酸生物标志物的快速比色定量

在新型冠状病毒肺炎COVID-19大流行的背景下，业界致力于开发在更短的时间内提供多种检测结果的检测方法。然而，基于聚合酶链式反应的分子诊断，其样品制备、核酸提取和检测仍然受到较长处理时间的挑战。与PCR方法相比，基于反转录环介导等温扩增和滚环扩增能够在恒定温度下，通过一步法放大RNA/DNA。在此过程中，核酸扩增释放H⁺，在pH敏感染料的存在下，能够改变溶液的pH和培养基的颜色，显示了基于LAMP和RCA的定量通用比色读数的潜力，可用于与定量PCR相当的即时诊断体系。然而，尽管比色读出具有高性价比的操作和易于自动化的优势，但在短时间内达到较高灵敏度的要求，限制了其在临床实际环境中的转化应用。自由电子的表面等离子体共振吸收光能，形成“热”电子，能够加速电-光化学反应。然而，等离子体纳米表面的这种独特性尚未在核酸扩增测试中进行研究。

QolorEX的工作原理

QolorEX平台的工作原理包括基于等离子体纳米表面实现等离子体热点催化和无标记的定量比色读数。其传感腔体由4个功能部件组成：作为电子释放界面的等离子体活性铝层，氧化锌层，由紧密排列的有机纳米颗粒组成的蜂窝状阵列，间距可调，并作为间隔层，最后是具有较大折射率的硅基底，产生高强度的光束反射。其中QolorEX的快速和定量输出依赖于核酸扩增和等离激元纳米结构引入的表面自由电子之间的相互作用。当等离激元纳米表面受到环境光照射时，自由电子的集体等离激元振荡以热电子注入介质的形式产生非辐射弛豫，可以在等离激元表面与介质的界面处催化电子驱动的核酸扩增。等离激元纳米表面界面处的电子解离促进了核酸扩增中磷酸二酯键形成的亲核反应，从而提高了反应速率。在放大反应过程中，产生可被变色化学试剂(如酚红)消耗的质子，以改变介质的折射率。

人唾液中QolorEX RT-LAMP检测方法的评价

基于QolorEX RT-LAMP检测体系，作者首先检测了一系列稀释浓度的野生型新型冠状病毒的灵敏度。在60 min的检测时间中，可以得到不同的颜色矩阵，显示了从紫红色到黄色的逐渐颜色变化。随着时间的推移，阳性检测信号显示出一致的增加，其中较高的信号与较高的病毒载量相关。作者使用针对SARS-CoV-2 RNA依赖的RNA聚合酶基因的高选择性RT-LAMP引物。同样，该信号与人唾液中每微升5-8 10⁵个RNA拷贝的生理范围内的病毒RNA浓度有直接的相关性。此外，在唾液样本中加入SARS-CoV-2 RNA随浓度呈线性信号趋势。

图1.人唾液中QolorEX RT-LAMP检测方法的评价^[1]

结论

本文提出了一种集成等离子体纳米表面和微流控芯片的分子诊断平台。该平台利用微型等离子体纳米表面微流体，实现等离子体热点催化，加速了基于逆转录环介导等温扩增和滚环扩增反应，并利用扩增反应产生的H⁺离子，实现基于酚红的比色分析。该平台对病原体的核酸生物标志物的检测时间短（13min），准确率高（95%）。

参考文献：

[1] AbdElFatah T, Jalali M, Yedire S G, et al. Nanoplasmonic amplification in microfluidics enables accelerated colorimetric quantification of nucleic acid biomarkers from pathogens [J]. Nature Nanotechnology, 2023, 18(8): 922-932.