45分钟、1个菌也能抓：中国团队把“Argonaute+试纸条”做成食品现场检测新利器

研究背景

WHO统计，食源性病原每年导致约6亿人次患病，单核细胞增生李斯特菌死亡率在易感人群中超过20%。该菌可在4 ℃繁殖，对即食肉、奶、海鲜构成持续威胁；同时，耐氟喹诺酮等耐药株增多，急需能同时检测“病原+耐药基因”且适合现场的方法。现有qPCR灵敏但依赖热循环仪，LAMP易假阳性，CRISPR/Cas又受PAM序列限制。嗜热古菌来源的Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）可编程切割任意DNA，不受PAM限制，却鲜少与便携试纸条联用。

研究内容

天津科技大学团队构建“PfAgo-反向增强荧光侧流条（rLFTS）”体系，目标是在45 min内完成“样品-结果”全链条、双基因、双重信号验证的现场检测。主要步骤如下：

1. 样品前处理与LAMP扩增

用等量快速裂解液与菌液混匀30 s，65 ℃ LAMP 15 min，同时扩增hly（毒力）与lde（耐药）保守片段。

2. PfAgo两步切割

扩增产物加入PfAgo/引导DNA复合物，95 ℃ 15 min。首轮切割产生16 nt 5'-磷酸化ssDNA；该片段作为新引导，触发第二轮切割，释放荧光报告探针，实现信号放大。

3. 反向增强侧流条读数

试纸条T1、T2线分别固定hly、lde捕获探针，C线为质控。

若靶基因存在，Linker DNA被切断，AuNPs@DNA探针无法被T线捕获→T线无色，但T线处罗丹明6G（R6G）荧光不被猝灭，呈亮荧光。

若靶基因不存在，Linker完整，AuNPs在T线聚集显红色，同时R6G荧光被AuNPs猝灭。

通过“有色/无色”与“荧光亮/暗”交叉验证，降低假阳。

4. 便携设备与App

3D打印可视器内置白光+365 nm UV，手机拍照后App自动圈选T/C线区域，输出比值并云端存档，全程无需大型仪器。

结果

灵敏度：纯培养液中1 CFU/mL即可检出，比同批qPCR（~100 CFU/mL）高两个数量级。

特异性：对11种非目标菌（含沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等）无交叉反应。

重复与再现：批内/批间RSD均<5%，三位操作员、三批试纸条结果一致。

稳定性：铝箔封装室温存120天，信号无衰减。

实际样品：在超市购得的巴氏奶、冷冻牛肉、虾仁中人为掺菌， enrichment 18-24 h后，PfAgo-rLFTS同样实现1 CFU/mL检出，与qPCR-TaqMan符合率100%，且未出现SYBR Green qPCR的2例假阴。

多重检测：同步检测hly+lde，单管可区分“病原+耐药”双阳性、单阳性或全阴性，极坐标图一目了然。

结论

该研究首次把PfAgo与反向增强荧光侧流条结合，借助“颜色-荧光”双通道交叉验证，实现45 min、单细胞水平、现场可读的食源性病原检测。设备仅需便携恒温器与3D打印读数盒，适合工厂、超市、口岸等一线场景，为冷链中李斯特菌及耐药株的快速筛查提供了新工具。

参考文献：1、Tang, Xiaoqin et al. “Ultrasensitive, portable and multiplexed molecular detection of pathogenic bacteria in a cross-validating manner via Argonaute-triggered and reverse-phase enhanced fluorescent lateral flow bioassay.” Journal of hazardous materials vol. 496 (2025): 139219. doi:10.1016/j.jhazmat.2025.139219