细胞受损怎么办？仿生人工细胞器修复技术来啦！

仿生的细胞器如同在自然界中一样，隔间的大小是完全不同的，人工细胞器的尺寸范围是纳米，而原细胞的尺寸范围是微米。通过工程仿生纳米结构来模仿生物过程是解决医学、材料科学、化学和电子等各个科学领域问题的一种趋于完美的策略。通过应用自下而上的仿生设计，即通过自组装在纳米级排列分子，有可能将以复杂结构和活性(如蛋白质、脂质、DNA)著称的单个生物单元与坚固的合成材料(如聚合物、多孔二氧化硅表面、纳米颗粒)结合起来。这有助于开发具有增强性能和功能的纳米仿生学，在敏感的生物传感、患者定制治疗具有广泛应用潜力。目前这一研究在两个方面取得了技术发展，第一个是基于为改进治疗和诊断提供有效解决方案的基本需要的人工细胞器(AOs)，第二个是提供细胞的简单模型以了解各种内部过程的原细胞系统。这项技术对于推进人工细胞器的医疗应用和模拟细胞行为至关重要。

摘要：

尽管许多研究在开发刺激反应酶递送系统方面做出了巨大的努力，但它们的功效大多局限于体外应用。在这里，我们介绍了一种结合生物分子和人工隔间的仿生策略，创建人工细胞器作为细胞植入物，内源性刺激触发酶活性。人工细胞器是通过在含有辣根过氧化物酶的聚合体的膜上插入蛋白质门而产生的，辣根过氧化物酶被选为参与氧化还原稳态的自然酶的模型。插入的蛋白质门是通过将分子帽连接到基因修饰的通道孔上，以诱导氧化还原反应控制分子通过膜的流动。人工细胞器保存其结构，并在体外被细胞内谷胱甘肽水平激活。重要的是，我们的仿生人工细胞器在斑马鱼胚胎体内具有功能，这证明了人工细胞器在活体生物体内作为细胞植入物的可行性。这为以患者为导向的蛋白质治疗开辟了新的前景。

仿生人工细胞器与生物分子作用机制示意图

图a为修饰的OmpF在催化纳米室中作为栅极的示意图。设计由环境条件的变化触发活性的AOs的关键因素是按需隔间对酶底物/产物的渗透性和聚合体的结构完整性，这模仿了自然细胞器。在PMOXA6-PDMS44-PMOXA6的聚合体膜上配备对细胞内环境中谷胱甘肽(GSH)浓度变化有响应的蛋白质门，同时保留纳米室的结构。图b是OmpF-M半胱氨酸突变体的分子表达示意图。通过使用OmpF37的双突变体将分子帽附着在基因引入的半胱氨酸残基上，当系统进入细胞内微环境时发生氧化还原电位变化时，半胱氨酸残基可阻断/解除OmpF孔。图c为自旋探针双-(2.2.5.5-四甲基-3咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物对OmpF-M半胱氨酸突变体的化学修饰。图d为荧光团SAMSA-CF对OmpF-M半胱氨酸突变体的化学修饰。OmpF-M的半胱氨酸残基与小分子量分子的硫醇基团形成二硫化物键的能力通过两种互补分析进行了检验，一种是使用合适的自旋探针(双(2.2.5.5-四甲基-3-咪唑啉-1氧基-4-基)二硫化物)，另一种是使用荧光染料SAMSA荧光素(SAMSA-cf)。

刺激响应型OmpF表面的特性反应示意图

图a和b为双(2.2.5.5-四甲基-3-咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物标记omfp - m实验(黑色)和模拟(蓝色)和双(2.2.5.5-四甲基-3-咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物标记omfp - m在1% OG中10mm DTT实验(黑色)和模拟(蓝色)孵育的EPR光谱。EPR光谱显示氮氧化物探针49在与OmpF突变体(OmpF- s- s- no)结合后旋转受阻，并显示双(2.2.5.5-四甲基3-咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物成功结合到修饰的OmpF突变体(图a)，将OmpF-S-S-NO暴露于10 mM DTT后，观察到自由旋转自旋探针的各向同性EPR谱(值为15.9 G)特征(图b)。图c中PBS中的SAMSA-CF(黑色)，1% OG中的SAMSA-CF(蓝色)和1% OG中的OmpF-S-S-CF(红色)的归一化FCS自相关曲线。虚线-实验自相关曲线，全线拟合。作者比较了SAMSA-CF在PBS (pH 7.4)中的分子亮度和扩散时间，SAMSA-CF在1% OG PBS (pH 7.4)中的分子亮度和扩散时间，以及SAMSA-CF与OmpF结合(OmpF- s - s - cf)在1% OG PBS (pH 7.4)中的分子亮度和扩散时间(图c)。通过比较SAMSA-CF的分子亮度(每个分子的计数，CPM以kHz为单位)和SAMSA-CF结合蛋白的分子亮度(4.8±0.6 kHz)，计算每个单体平均两个SAMSA-CF分子的标记效率(图c)。图d是OmpF-M在30 mM GSH、1% OG中的SAMSA-CF释放动力学，通过FCS测量并采用双组分拟合分析。误差条表示60次测量的标准偏差。由于染料和OmpF-M之间的二硫化物键发生裂解，自由染料的百分比随着时间的推移增加到85±9%，在1小时后趋于稳定(图2d)。自由染料百分比的标准偏差是基于同一探针(n = 60)在固定时间点的单个测量。

刺激响应催化纳米室的表征示意图

图a为低温透射电镜显微图:(左)装载了HRP并配有OmpF- sh的聚合体，(中)装载了HRP并配有OmpF- s - s - cf的聚合体，(右)装载了HRP但没有OmpF的聚合体。比例尺= 100 nm。通过电镜图显示PMOXA6-PDMS44-PMOXA6共聚物在HRP、HRP和OmpF-S-SCF或HRP和OmpF-S-S-NO存在下自发自组装，并通过低温tem鉴定出空心球形腔室。图b是PBS中的SAMSA-CF归一化FCS自相关曲线(黑色)和聚合体膜中的OmpF-S-S-CF(蓝色)。虚线和实验自相关曲线，实线=拟合曲线。曲线归一化为1.便于比较。c左图:PMOXA-PDMS-PMOXA聚合体中重组的双(2.2.5.5-四甲基-3-咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物标记的OmpF的EPR谱(黑线)。通过比较游离荧光团的分子亮度(CPM = 2.2±0.7 kHz)和配备OmpF-S-S-CF的聚合体(CPM = 18.9±11.1 kHz)，计算出OmpF-S-S-CF孔/聚合体共有5个;这些值与之前报告的野生类型OmpF的值相似。图c的右面板为双(2.2.5.5-四甲基-3-咪唑啉-1-氧基-4-基)二硫化物标记的OmpF在PMOXA-PDMS-PMOXA聚合体中重组，用10mm DTT实验(黑线)和模拟(蓝线)孵育。含有OmpF-S-S-NO的酶载聚合体产生广泛的EPR谱(图c)，表明低迁移率，结果与插入聚合体膜的5-DSA和16-DSA相似55.然而，当这些含有OmpF- s - s - no的HRPloaded聚合体暴露在还原条件下(10 mM DTT)，观察到宽峰上叠加了一个各向同性的EPR谱(an = 15.9 G)，表明一些氮氧化物自旋探针从OmpF上成功裂解(图c)。图d中Amplex Ultra Red的酶载聚合体转化:立即加入30mm GSH(左)，1小时后加入30mm GSH(右)。OmpF-S-S-CF配置的载酶聚合体(绿色)和OmpF-SH配置的载酶聚合体(蓝色)。误差条表示三个分别制备的催化纳米室之间活性的标准偏差(n = 3)。这表明，通过减少附着的SAMSA-CF帽和OmpF-M半胱氨酸残基之间的二硫化物桥，释放分子帽，成功地恢复了OmpF-M对酶底物的孔渗透性。

人工细胞器的细胞摄取和细胞内活化示意图

图a中HeLa细胞的共聚焦荧光显微照片显示细胞摄取荧光标记的HRP负载的聚合体和荧光标记的HRP负载的AOs。比例尺:10µm。然后我们将带标签的hrp封装在聚合体的空腔内，分别是带有OmpF-SS-CF的聚合体和带有OmpF-SH的聚合体。HeLa细胞的细胞摄取试验表明，细胞内化成功，细胞内颗粒染色模式在8 - 24小时内呈时间依赖性增强。图b为细胞摄取和细胞内激活荧光标记的hrp负载的聚合体和荧光标记的hrp负载的ao。蓝色信号:Hoechst 33342核染色。灰色信号:CellMask深红色等离子膜染色。绿色信号:Atto488 HRP。红色信号:间苯二酚类产物(RLP)。比例尺20 μ m。与未处理的细胞相比，或与无OmpF的hrp装载聚合体孵育的细胞相比，配备OmpF- s - s - cf或OmpF- sh的AOs细胞内荧光显著增加。

人工细胞器在体外和体内巨噬细胞中的内化和活性示意图

图a是将ZFE中的人工细胞器转化为自身的。ZFE注射了hrpatto647加载的人工细胞器，并配备了OmpF-S-S-CF。箭头:面向对象的本地化。蓝色信号:ZFE黑色素细胞。绿色信号:GFP巨噬细胞。红色信号:加载atto647的人工细胞器。ZFE免疫系统对以聚合体为基础的人工细胞器的显著识别，通过将装载atto647结合的HRP (Atto647-HRP)的人工细胞器注入到巨噬细胞中专门表达eGFP的转基因ZFE中证实了这一点。图b为人巨噬细胞分化THP-1细胞对人工细胞器的体外吞噬作用定性(图中)和定量分析巨噬细胞分化的THP-1细胞与人工细胞器加载atto488标记的HRP，不添加抑制剂(左)，存在吞噬抑制剂细胞松弛素B (Cyto B)(右)。蓝色信号:Hoechst 33342核染色。绿色信号:Atto488 HRP。比例尺插入20 μ m。巨噬细胞对人工细胞器的吸收被细胞蛋白酶B显著抑制(MFI增加0.13倍)，叠氮化钠抑制程度较低(MFI增加0.43倍)，这表明一种依赖能量的吞噬内化过程。图c为流式细胞术定量存在不同药理途径抑制剂的人工细胞器:聚肌苷酸(Poly(I: C))、秋水仙素、细胞松弛素B (Cyto B)和叠氮化钠(NaN3)。图d是体内ZFE的生物分布和人工细胞器的活性- ZFE横截面的横向视图。蓝色信号:ZFE黑色素细胞。绿色信号:HRP-Atto488.红色信号:reazurin -like产物(RZLP)。箭头显示人工细胞器酶活性区域。

总结：

1.本文中作者设计和开发能够在细胞内发挥作用并支持自然细胞器的设计和开发能够在细胞内发挥作用并支持自然细胞器的人工细胞器是创造细胞植入物的必要步骤。作为原始细胞的补充概念，人工细胞器响应了一种基本需求，为改进的治疗和诊断方案提供有效的解决方案。

2.在人工细胞器中保留了原始细胞器的结构，并在到达细胞微环境后被激活。更令人兴奋的是，它们在脊椎动物ZFE模型中具有功能，这证明了人工细胞器作为细胞植入物的概念在体内是可行的。此外，与现有的酶替代方案(如直接酶传递和转染)相比，人工细胞器的稳定性、生物相容性和低毒在医疗应用上具有真正的优势，。

3.本文章的策略的高度通用性将允许通过改变包覆酶和/或蛋白门的刺激响应特性，直接开发出大量用于特定医疗应用的人工细胞器。然而，需要仔细选择底物，以克服通过特定底物质膜的有限能力，这通常用于大块酶促反应。

4.通过细胞微环境的变化激活AOs并在体内保持功能的这个例子，打开了AOs内部复杂原位反应的视角，代表了多功能系统的生成的重要进步，将支持个性化医疗的发展。

参考文献：

T. Einfalt, D. Witzigmann. Edlinger, S. Sieber, R. Goers, A. Najer, M. Spulber, O. Onaca-Fischer, et al. Biomimetic artificial organelles with in vitro and in vivo activity triggered by reduction inmicroenvironment. NATURE COMMUNICATIONS (2018) 9:1127.

DOI：10.1038/s41467-018-03560-x