肠道细菌感染的体外和离体建模

  1、体外和离体建模的作用

  体外模拟人体肠道对于肠道感染的机制研究和胃肠道疾病药物的开发具有十分重要的意义。人类永生化细胞系的2D单层培养一直是研究传染病生物学的主要体外范式，这种方法为研究各种肠道细菌感染的毒力和发病机制提供了基本的见解，能够揭示感染过程的分子机制。近年来，出现了各种生物工程肠道体外和离体系统，包括类器官培养、基于支架的3D模型和微生理系统。这些模型能够更准确地在细胞和分子水平上捕获肠道表型，研究粘液产生和组成、共生体-病原体相互作用、免疫串扰和肠道蠕动相关的效应。

  2、肠道单层培养模型

  单层培养即细胞在平坦的坚硬表面上以单层形式培养，例如在培养皿、组织培养瓶或多孔板中。单层的主要优点是标准化的实验设置、可重复性和药物研究的适用性，已被成功用于研究各种细菌肠道病原体及其毒素所采用的不同感染机制(图1)。同时单层培养形式具有高度可扩展性、价格低廉且易于高通量分析。但这种模型不容易区分发生在顶端或基底外侧的事件，因此不适合涉及细胞极性的研究。为了改善这些限制，已经开发了Transwell培养物。Transwell培养促进极化肠上皮的体外发育，被广泛用于肠通透性和极性的研究。用于肠道传染病生物学研究的最流行的细胞模型是未分化的细胞系，例如宫颈上皮细胞系HeLa，Henle-407和肾上皮细胞系HEK293，以及肠细胞来源的结直肠腺癌细胞系Caco-2和HT29。

  图1：使用2D单层培养揭示的肠道细菌的关键感染机制概述。图示显示了霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的侵袭机制和细菌-宿主相互作用。

  2.1 单层培养模型的作用

  1)系统鉴定感染所需的宿主因子或预防感染的宿主因子;

  2)确定毒力因子及其调节途径;

  3)发现将感染与细胞发病机制联系起来的代谢物和翻译后修饰。

  2.2 单层培养中肠道细菌感染的建模

  志贺氏菌：使用单层培养模型可以剖析不同毒力性状(如宿主细胞侵袭和志贺毒素产生)，有助于发现新的微生物毒力性状和详细解剖传染病过程的分子机制。例如体外研究表明，志贺氏菌在细胞内和细胞间运动是通过IcsA上的N-WASP通过肌动蛋白聚合决定的。

  鼠伤寒沙门氏菌：体外模拟可以用于研究鼠伤寒对肠细胞的粘附和侵袭以及鞭毛蛋白引起的肠细胞中促炎细胞因子反应的诱导。

  伤寒沙门氏菌：伤寒沙门氏菌引起严重的全身性疾病。使用肠细胞、血管内皮细胞和免疫细胞的单层培养物用于伤寒毒素参与不同靶细胞类型的不同受体。

  致病性大肠杆菌：大肠杆菌已经多样化为许多肠内和肠外病理体。Caco-2单层培养物在开发抗感染药物方面取得了显著成功，这些抗感染药物通过阻断肠细胞进入的细菌机制起作用。

  3、先进的肠道培养系统

  单层培养模型并不适用于需要长期维持、准确的细胞和分子表型、不同肠道细胞类型之间的串扰、蠕动运动或病原体与复杂的共生微生物组之间的相互作用的发现研究。此外，使用细胞系的研究无法很好地研究个体间差异的影响。为了克服这些限制，近年来已经开发了各种不同的器官型和微生理体外和离体模型。

  3.1 肠道类器官培养

  干细胞研究的进步促进了3D细胞培养系统的开发。肠道类器官可以来源于组织驻留的成体干细胞、胚胎干细胞或使用基质胶作为支架的诱导多能干细胞。在含有特定丝裂原和分化因子的培养基中，这些细胞增殖，并在一系列分裂后自组织成含有肠细胞的微组织。

  近年来，类器官已被用于模拟病原体感染。这些系统有望解决宿主-微生物相互作用、传染病和由此产生的炎症状况中的新问题。由于类器官捕获了人类肠上皮的细胞复杂性，因此它们非常适合研究具有窄细胞型嗜性的病原体及其细胞特异性相互作用的相应机制。

  图2：模拟肠道感染的器官型和微生理培养方法的示例

  3.2 生物工程支架模型

  生物工程支架模型是将细胞放在类似于原位组织结构的特定3D支架上培养。该模型中的坚硬的底物使细胞平整，而生理基质弹性维持细胞极性。肠粘膜下支架广泛用于体外模拟肠上皮。接种有Caco-2细胞的支架被用于研究空肠梭菌的感染。3D支架也被用于培养来自解离的肠道类器官的细胞，从而开发出具有隐绒毛结构、适当的细胞谱系区室化和专用干细胞壁龛的人类小肠上皮的生理相关模拟物。3D生物工程支架还可以与完整类器官的培养物相结合。该支架上的培养或肠道类器官导致支架上皮化，并在不需要类器官解离的情况下正确形成功能不同的绒毛和隐窝结构域，从而为未来的传染病研究提供了一种通用手段。

  3.3 微生理装置

  微工程技术的进步导致了微生理系统的发展，其中细胞在具有静水力和机械变形的灌注环境中培养。第一个灌注肠道模型是基于一个由两个微通道组成的系统，这两个微通道被一个刚性半透膜隔开，Caco-2细胞接种在上面。微流体模型还与需氧和厌氧人类肠道微生物群落的稳定共培养以及生理氧梯度在工程厌氧室中的应用兼容，从而可以维持相关水平的微生物多样性。

  3.4 肠溶离体模型

  离体培养，从肠道切片或外植体的短期培养到麻醉动物肠袢的活体分析，构成了肠道体外系统库的重要补充。动物(主要是兔子或小鼠)被剖腹手术，然后暴露几厘米的肠袢，连接并注射确定的细菌悬浮液。随后对感染组织和未感染控制环的组织学和生化评估揭示了重要的疾病机制和宿主反应，并能够制定针对各种肠道感染的保护策略，包括弗氏链球菌、产气荚膜梭菌、肠致病性大肠杆菌和空肠衣原体。最常见的离体培养模型是基于Ussing室系统，其中上皮垂直安装以分隔两个腔室。通过测量相邻隔室中电极之间的电位差，该装置可以量化上皮屏障特性、渗透性以及离子传输。

  4、总结

  单层培养仍然是高通量应用的首选方法，例如基于转座子诱变、RNA干扰、基因编辑或药理调节的大规模筛选。肠道类器官为体外重建人体肠道的细胞复杂性提供了前所未有的机会，它们为生物工程系统提供了关键的构建块。3D支架和微生理系统的主要优点是能够重建肠道组织结构并整合生化梯度，流动和机械线索，从而延长体外培养物的功能寿命，允许培养以前不可培养的病原体，并促进生理相关和稳定的微生物组的结合。完整组织外植体的离体培养和结扎肠袢的活体成像有助于发现肠道感染对液体分泌的影响，以及免疫细胞在其天然微环境中感染时的行为。这些新兴的、复杂的体外和离体系统不是传统2D培养的替代品，而是作为补充，每个系统都可以解决独特的问题。

  图3：适用于研究肠道细菌感染和宿主-病原体相互作用的生物学模型的代表性示意图。

  参考：https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2158034

  原文题目：In vitro and ex vivo modeling of enteric bacterial infections