生物硫醇（包括Cys、Hcy、GSH和NAC）在生物细胞和血清中扮演着关键且各不相同的角色。它们的浓度失衡与多种疾病相关，如Cys水平异常与肝损伤、心血管疾病等有关；Hcy水平异常可能引发老年人认知障碍；GSH失衡与癌症、阿尔茨海默病相关；NAC在多种慢性疾病治疗中具有潜力。因此，精准区分这些生物硫醇至关重要，但它们化学性质相似，传统分析方法存在局限性，荧光成像虽具优势，现有荧光探针仍难以有效区分这些结构相似的生物硫醇。

宁波工程学院与湖南师范大学联合研究团队在生物分析领域取得创新性进展，开发出新型双通道荧光探针CNTC，首次实现对细胞内半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）的实时可视化鉴别。该成果以图文并茂的形式发表于《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》，结合光谱分析与细胞成像数据，揭示了生物硫醇在生理环境中的独特行为。

研究内容

图 1 CNTC与生物硫醇反应的吸收和荧光光谱变化

如图1显示，CNTC与Cys作用后，在400 nm处出现新吸收峰，荧光强度在450 nm（蓝色通道）增强90倍；而与Hcy、GSH、NAC结合时，原吸收峰蓝移，536 nm（绿色通道）荧光强度分别提升150、230、250倍。

这种“蓝色通道专属Cys，绿色通道响应其他硫醇”的特性，通过光谱差异实现了零交叉干扰的同步检测。 

图 2 CNTC对生物硫醇的时间依赖性荧光响应

在时间依赖性与色度变化实验中发现，加入Cys后30分钟内，蓝色荧光强度持续上升，CIE色度图中颜色从黄色变为蓝色；而加入GSH后，绿色通道荧光增强，颜色向绿色偏移。这种动态色度变化不仅验证了探针的快速响应（≤30分钟），还为智能手机实时色度分析提供了技术基础，有望开发便携检测设备。

图 3 活细胞中生物硫醇的双通道荧光成像

共聚焦显微镜图像显示，HepG2细胞经CNTC处理后，外源性Cys仅激发蓝色荧光，而Hcy、GSH、NAC则特异性点亮绿色通道；经巯基清除剂NEM预处理的细胞无荧光信号，证实了探针响应的巯基依赖性。

内源性硫醇检测实验中，CNTC同样能清晰区分不同硫醇的分布，表明其在复杂细胞环境中的适用性。

图 4 CNTC的结构与反应机制

CNTC的独特性能源于其双反应位点设计（图4）：位点1（对硝基苯硫醚）对Hcy、GSH、NAC的巯基具有高选择性，通过亲核取代反应触发绿色荧光；位点2（氰基丙烯酸酯）仅与Cys发生迈克尔加成反应，形成七元环结构，导致蓝色荧光增强。理论计算显示，硝基苯基团的电子吸收能力强于香豆素荧光团，通过光诱导电子转移（PET）机制实现探针“关闭态”；与硫醇反应后，PET被阻断，荧光信号“开。

在灵敏度、选择性与生物相容性性能检测中发现：CNTC对Cys、Hcy、GSH、NAC的检测限分别为0.31、0.11、0.029、0.032 μM，优于多数单通道探针；并且在40余种干扰物（如金属离子、氨基酸、活性氧）存在下，CNTC仅对目标硫醇产生显著荧光响应；最后经MTT实验证实，探针浓度≤10 μM时细胞存活率＞90%，满足活体成像需求。

该研究开发的CNTC探针基于p-硝基硫酚香豆素-氰基模块，具有多个结合位点，可实现对Cys与其他生物硫醇（Hcy、GSH和NAC）的双通道区分检测。其独特的反应机制使荧光显著增强，有助于生物样品中这些生物硫醇的灵敏检测。共聚焦荧光成像进一步证实了CNTC在活细胞中对内源性和外源性生物硫醇的有效成像能力，为研究细胞功能、药物开发以及与异常生物硫醇浓度相关的早期疾病诊断提供了有力工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.saa.2024.125221