一、原理

  革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。

  二、 革兰氏染色的步骤

  革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液;媒染剂;脱色剂和复染液。碱性染料初染液结晶紫的作用：碱性染料并不是碱，是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。媒染剂碘的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。脱色剂95%的酒精是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能。复染液番红也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群。

  革兰氏染色法一般包括五个步骤涂片干燥固定、结晶紫染色液初染1min、碘液媒染1min、95%酒精脱色20～30秒、沙黄复染1min，具体操作方法是：

  (1)涂片干燥固定：取洁净载玻片，在中心滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环(灭菌牙签)挑取少量菌苔于水滴中混匀并涂成薄膜(涂膜的大小通常1cmX2c)，涂成一薄层并使细胞均匀分散(厚度(以透过涂膜能辨认报纸上的文字为宜))。在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。(60℃干燥，但不建议加热干燥，因加热可造成菌体变形)。把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。

  (2)初染：用结晶紫染色液初染1分钟，水洗、甩干。

  (3)媒染：加一滴革兰氏碘液媒染1分钟、水洗、甩干。(此时结晶紫与碘液成复合物)

  (4)脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约20～30秒，立即水洗、甩干。

  (5)复染：用沙黄或碱性复红复染1～2分钟，水洗晾干或用吸水纸吸干或用电吹风吹干。

  (6)镜检：在香柏油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异(革兰氏阳性菌体呈紫色，革兰氏阳性菌体呈红色)，并观察菌体形态。在油镜下观察菌体形态(球、杆或球杆状);排列(双球菌、四联、八叠、短链或长链、葡萄状、柴捆状等);染色性(革兰染色阳性、阴性或不确定)。

  三、 革兰氏染色成败的控制点

  (1)涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察;

  (2)染色时间。染色时间过长，结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判;

  (3)乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌;若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。

  (4)菌龄：应12小时～24小时的纯培养物。如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

  四、 生物显微镜的正确使用

  普通光学生物显微镜可用于观察悬滴标本中病原体的动力，观察涂片染色标本中病原体的形态、排列和染色性，也可用于对标本中细胞数的观察从而判断标本的合格性。

  (1)生物显微镜置于光线充足处，调整目镜筒以适应操作者两眼间距。

  (2)调整载物台与物镜的距离，调节光圈和反光镜。对染色标本光线宜强，对无色或未染色标本光线宜弱;低倍镜观察光线宜弱，高倍镜观察光线宜强。

  (3)置载玻片于载物台上，用弹簧夹固定， 先使用低倍镜快速发现目标，从低倍镜转至高倍镜时，只需略微调动细调焦旋钮，换油镜观察时，将光圈完全打开，调整至最亮，在玻片上滴加一滴镜油，从侧面仔细观察，直到油镜头浸入镜油，再用目镜观察，其间用细调焦旋钮进行调节。

  (4)使用完油镜后先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用沾上二甲苯的擦镜纸擦拭，最后用干净擦镜纸擦干，并且要把载物台擦拭干净。二甲苯致癌，可用代替方法：85%石油醚，15%异丙醇或无水乙醇：乙醚=3：7或1：1。

  五、 生物显微镜功能维护

  (1)日常保养

  1) 生物显微镜使用完毕，应移去玻片，擦拭镜头，使物镜头呈V字型偏于两旁，降下镜筒，将光亮度调至最暗，再关闭电源按钮，防止下次开机时瞬间电流过强烧坏光源灯。

  2) 保持生物显微镜清洁,防止灰尘和砂粒对光学系统的影响以及对机械系统的磨损。

  3) 镜箱内放置干燥剂防潮,防止镜片和镜头生霉、生雾，防止机械零件生锈。

  4) 对滑动部位，可涂中性润滑脂润滑。

  (2)光学系统的保养

  1) 较顽固污渍的处理：用长纤维脱脂棉或干净的棉布蘸少量二甲苯或镜头清洗液(3份乙醇：1份乙醚)擦拭，然后用干净细软的绸布擦干或用吹风球吹干。

  2) 物镜和目镜生霉生雾的处理：将不同镜头单独分开放置于干燥器皿中，用棉花棒、纱布、柔软的刷子等蘸取30%无水乙醇+70%乙醚擦拭。擦洗镜头时，不能过度用力，以防止损伤镀膜层。目镜可拆下来清洗，物镜不要自行拆下。

  六、 生物显微镜使用注意事项

  (1)生物显微镜镜头的数值孔径标准简写为NA

  (2)常用物镜可按放大率分为低倍(4X)、中倍(10X或20X)、高倍(40X )和油浸物镜(100X)。

  (3)不要用手触摸目镜和物镜;降镜筒时，一定要从旁边注视物镜，防止物镜碰到盖玻片

  (4)观察时先用低倍镜，再用高倍镜;先调粗准焦螺旋，看到物像后再用细准焦螺旋进行微调;每次用完后，用擦镜纸将目镜、物镜擦干净。

  (5)凡是生物显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸擦拭，不能乱用他物擦拭，更不能用手指触摸透镜，以免汗液玷污透镜。

  七、 如何在生物显微镜下区分上述四大类微生物?

  1) 细菌：相对较小，细菌特有的荚膜或芽孢(折光的)。

  2) 放线菌：大量分支发达的菌丝，有螺旋状孢子丝。

  3) 霉菌：根霉是有假根，匍匐菌丝，孢子囊或者散开的孢子。青霉明显扫帚状。

  4) 酵母菌：单细胞真菌，有细胞器，体积大，很低倍的生物显微镜都能看到。

  八、 革兰氏染色液配制