用于检测人血清中抗SARS-CoV-2中和抗体的超亮纳米颗粒标记的免疫层析法

  抗 SARS-CoV-2中和抗体(Nab)的水平是评估针对SARS-CoV-2的获得性保护性免疫不可或缺的参考。本文建立了一种基于超亮纳米颗粒的免疫层析法 (LFIA)，用于一步快速半定量检测疫苗接种者血清中的抗SARS-CoV-2 NAb。一旦嵌入聚苯乙烯(PS)纳米颗粒中，聚集诱导(AIE)发光剂AIE 490由于PS 的刚性和对分子内运动的严重抑制而表现出超亮荧光。超亮AIE 490-PS纳米颗粒用作LFIA的荧光标记。在优化条件下，包括孵育时间、包被蛋白和结合纳米粒子的浓度、纳米粒子表面修饰的抗原量、血清样品的稀释率等，基于超亮纳米粒子的LFIA可以准确识别人血清中的70个阴性样品和63个阳性样品(p< 0.0001)。所建立方法的批内和批间精度分别在13%和16%以上。所建立的LFIA作为一种抗SARS-CoV-2 NAb的快速半定量检测方法具有巨大的推广实用价值。同时，AIE 490 -PS 纳米粒子也有望通过改变表面的蛋白质来检测其他分析物。

  由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的 2019年冠状病毒病(COVID-19)已成为全球流行病。目前，针对SARS-CoV-2的疫苗接种是预防这种传染病的关键策略。非常需要评估疫苗接种后获得性免疫的有效方法。检测针对 SARS-CoV-2 的特异性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)用于评估疫苗的效果。然而，只有一小部分IgM和IgG可以中和SARS-CoV-2，特异性IgM和IgG的阳性检测并不是对SARS-CoV-2获得性免疫的可靠评价。SARS-CoV-2的病毒进入是通过SARS-CoV-2的刺突蛋白中的受体结合域(RBD)识别人体细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)来介导的。接种疫苗后获得的中和抗体(NAbs)可以竞争性结合RBD并中和SARS-CoV-2。因此，直接检测NAbs是评估疫苗效果更准确的方法。同时，人体内NAbs的检测可以协同指导针对新病毒变体的疫苗策略，具有一定的参考意义。

  常规病毒中和试验由于活病毒操作需要生物安全三级设施，而基于假病毒的病毒中和试验需要生物安全二级设施。高标准的条件成本高，需要专业的操作人员，这对于大量检测NAbs是不切实际的。因此，一些方便的方法，如侧向流动免疫分析(LFIA)、酶联免疫吸附分析、表面等离子共振分析，以及一些新兴的数字微流体系统，可被开发用于检测SARS-CoV-2 NAb。其中，LFIA方法具有便携性、快速性、简单性和低成本等优点，已广泛应用于即时免疫传感器。例如，基于胶体金和彩色纤维素纳米颗粒的LFIA最近被开发用于检测SARS-CoV-2 NAb。然而，由于其比色信号受限，灵敏度不够，线性范围通常很窄。幸运的是，荧光信号可以提供更高的灵敏度，而基于荧光标记的LFIA可以提高工作线性范围。通常，免疫测定法包括竞争性免疫测定法和夹心免疫测定法。夹心免疫测定通常具有更高的灵敏度和特异性。然而，NAb是一系列可以中和SARS-CoV-2的抗体，其成分很复杂。在NAb上很难找到两个不同的结合位点。因此，夹心免疫测定法不适用于NAb检测。同时，直接竞争免疫测定比夹心免疫测定更便宜、更可靠，批次间的差异较小，这对于大量检测NAb很重要。本研究采用直接竞争免疫测定法。

  基于荧光标记的LFIA的灵敏度很大程度上取决于荧光材料。明亮的纳米材料，如量子点和镧系微球通常用于LFIA。与金属发光体相比，有机发光体的颜色和荧光波长可以通过化学结构工程轻松调节。然而，当将大多数发光剂引入纳米粒子时，由于聚集态的强烈π-π堆叠，大多数发光剂会发生聚集引起的猝灭 (ACQ)或在测试线上自聚集，这会降低LFIA的检测性能。近年来，具有聚集诱导发射的有机发光体(AIEgens)因其在聚集态或高浓度下的明亮荧光而受到广泛关注，它可以克服传统发光体的缺点。由于AIEgens的明亮荧光来源于分子内旋转限制和非辐射衰变的抑制，AIEgens堆积越密，荧光越亮。因此，AIEgens 通常以密集填充形式使用，例如表面活性剂基质-AIEgen 纳米颗粒、无定形或结晶沉淀物。表面活性剂基质-AIEgen纳米颗粒和无定形沉淀物可以限制分子内旋转并屏蔽水的影响，从而使AIEgens发出明亮的荧光。但它们的堆积比结晶状态要松散得多，在结晶状态下，AIEgen分子排列有序且致密，分子内旋转较少，荧光超亮。然而，AIEgen的纳米晶与抗体结合困难以及从垫上释放困难，这些问题限制了超亮AIEgen纳米晶在LIFA中的应用。要将超亮AIEgens引入LIFA，需要正确格式的 AIEgens。

  这项工作建立了基于AIEgen包埋的聚苯乙烯(PS)纳米粒子的LFIA，并成功检测了疫苗接种者血清中的抗SARS-CoV-2 NAb。PS是一种具有疏水链和空间苯环的刚性聚合物。假设一旦AIEgen嵌入PS颗粒中，PS颗粒的刚性会严重抑制分子内运动并触发超亮荧光。研究表明，绿色荧光AIEgen(AIE 490)的荧光信号在被封装到羧基修饰的PS纳米粒子(AIE 490 NP)中后增强了10倍以上。用ACE2 Fc嵌合体(ACE2-AIE 490 NP)修饰AIE 490 NP作为荧光标记物；将SARS-CoV-2核衣壳S RBD融合体包被在硝酸纤维素膜上作为检测线。当样品为阴性(不含NAbs)时，由于ACE2-RBD结合力强，检测线呈现出明亮的荧光信号；当样品呈阳性时(含NAbs)，由于通过NAb-RBD结合抑制了ACE2-RBD的结合，测试线呈现出微弱的荧光信号。受益于AIE 490 NP的超亮荧光，使用基于AIE 490 NP 的LFIA准确鉴定了63份来自疫苗接种者的阳性血清样本和70份SARS-CoV-2前阴性血清样本。理论上，如果NAbs的标准样品可用，也可以使用基于AIE 490 NP的LFIA来量化NAbs的浓度。同时，一次检测可在20分钟内完成，LFIA试纸携带方便，成本低廉，这对于SARS-CoV-2相关抗体检测和疫苗研究的广泛应用具有重要意义。

  参考文献：Lun Bian, Zhaoyue Li, An He, Biru Wu, Hui Yang, Yingsong Wu, Fang Hu, Guanfeng Lin, Deqing Zhang. Ultrabright nanoparticle-labeled lateral flow immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies in human serum. Biomaterials (2022) DOI: 10.1016/j.biomaterials.2022.121694