基于表面涂层的氧化钨铯-荧光碳点对细菌无线电化学和发光检测以及光热消融的研究

  摘要：简单快速的同时检测和杀灭细菌对于解决与病原菌有关的健康问题至关重要。在这里，基于阳离子聚合物合成表面可涂覆的电化学-荧光碳点(FCD)，设计了一种用于细菌检测的无线电化学和发光传感器。此外，通过利用荧光碳点表面的邻苯二酚与氧化铯钨(CsWO3)集成，进一步与近红外(NIR)响应，进行光热抗菌。氧化铯钨-碳点纳米杂化物显示出强烈的荧光发射，由于阳离子碳点表面和阴离子细菌细胞壁之间的相互作用，荧光发射被猝灭，这种相互作用也可以根据与细菌结合前后电阻值的变化进行电化学观察。在本研究中，使用荧光法测定大肠杆菌的检测限(LOD)为70 CFU/mL，金黄色葡萄球菌的检测限为131 CFU/mL，使用电化学法测定两种细菌菌株的检测限均小于10 CFU/m，表明电化学法是更灵敏的方法。此外，基于电化学的细菌检测分析可以开发成无线细菌传感系统，可以通过智能手机轻松实时监测。由于氧化铯钨的光热转化，这种纳米杂化物能够在近红外(NIR)暴露时引起细菌的光热分解，仅使用1 mg/mL的氧化铯钨-碳点即可杀死几乎100%的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。因此，这种纳米杂化物为基于电化学和发光的双重细菌检测以及高抗菌活性提供了一种新的方法。

  细菌光热消融与检测平台的原理

  如图所示，图a)为氧化铯钨-荧光碳点的合成途径，图b)为基于氧化铯钨-荧光碳点的平台的应用，合成的纳米复合材料带正电，与表面带负点的细菌能够发生相互作用结合，利用荧光碳点表面邻苯二酚的粘合功能，更有利于表面涂层，使该平台在液体和固体状态下进行检测都成为了可能。在发光检测中，合成的氧化铯钨-荧光碳点显示出强荧光发射，与细菌结合后，荧光发生猝灭。这种变化在测量电阻值变化的电化学中也能够实现，且电化学方法可用于无线细菌传感，通过智能手机直接获取数据。此外，氧化铯钨-荧光碳点通过产生光热，在近红外辐射下同时显示出对革兰氏阳性和阴性菌株的抗菌作用。因此，氧化铯钨-荧光碳点在近红外区域下具有杀灭细菌的潜力。

  结构表征

  图a)为荧光碳点和氧化铯钨-荧光碳点的吸收光谱，可以看出，荧光碳点在255 nm和360 nm处有吸收峰，这对应于邻苯二酚结构中芳香环的π-π*跃迁。然而，在制造氧化铯钨-荧光碳点纳米杂化物之后，由于邻苯二酚部分和金属纳米颗粒之间的相互作用，360 nm峰发生了蓝移。可见近红外区域中的峰的存在表明氧化铯钨纳米颗粒的存在;图b)为荧光碳点和氧化铯钨-荧光碳点的DLS分析，图中可以看出，荧光碳点的水合粒径21.04 nm，而氧化铯钨-荧光碳点的水合粒径为164.20 nm，粒径的明显增加充分的证明了氧化铯钨和荧光碳点耦联成功;图c)和d)分别为氧化铯钨-荧光碳点的SEM、TEM和EDX元素光谱图，图中可以看出，氧化铯钨-荧光碳点呈圆形形态，EDX元素映射之后，在纳米杂化物中清楚地观察到元素Cs和W，氧化铯钨-荧光碳点的晶格结构由0.30 nm(荧光碳点)和0.37 nm(氧化铯钨)的晶格间距表示;图e为XRD分析纳米杂化结构，氧化铯钨特征峰在2θ(24°-37°)的范围，由此证明了氧化铯钨固定成功。

  基于荧光的细菌检测和溶液中的光热性质

  图a)和b)分别为氧化铯钨-荧光碳点与不同浓度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的发射光谱，图中可以看出随着菌浓度的增加，荧光强度逐渐减弱;图c)为107 cfu/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别处理氧化铯钨-荧光碳点后的共聚焦图像，图中可以看出，在没有细菌的情况下杂化结构呈现明显的蓝色荧光，而加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后，荧光几乎完全被猝灭;图d)为流式细胞术分析，用大肠杆菌处理后，氧化铯钨-荧光碳点纳米杂交体的平均荧光强度从190降低到139，用金黄色葡萄球菌处理后，从190下降到153。因此，荧光猝灭现象清楚地证明了氧化铯钨-荧光碳点纳米杂化物的阳离子表面与细菌细胞壁上的阴离子位点之间的相互作用。

  图a)在不同的氧化铯钨-荧光碳点浓度下，有和没有(对照)近红外照射的活菌数，图中可以看出，在没有近红外光照时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌活力很高，表明氧化铯钨-荧光碳点显示出低细胞毒性。相比之下，在存在近红外辐射的情况下，氧化铯钨-荧光碳点纳米杂交体显示出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的显著光热杀灭能力;图b)表明，随着激光功率的增加，杀菌效率会更加明显;图c)表明，随着杀菌时间增加，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的杀菌效率也显著增加;图d)为在近红外光照和无近红外光照条件下的激光共聚焦显微镜图，图中可以看出，当没有近红外光照时，显微镜中出现大量绿色荧光(活菌)，而当利用红外光照时，显微镜中出现大量的红色荧光(死菌);图e)为在1 mg/mL的氧化铯钨-荧光碳点条件下， 5分钟近红外照射前后对活细菌和死细菌进行流式细胞术分析，图中可以看出，近红外照射后，出现大量的死菌;如图f)所示，我们发现氧化铯钨-荧光碳点纳米结构在没有近红外光照下，表现出了良好的生物相容性，这由氧化铯钨-荧光碳点处理的MDCK细胞的高水平细胞活力证实。

  固体涂层的氧化铯钨-荧光碳点的荧光检测以及抗菌活性

  为了建立涂层表面荧光检测方法，我们建立了几种衬底用于纳米杂化结构涂层，图a)中可以看出聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚氯乙烯(PVC)表面的接触角减小，但硅晶片的接触角增大，表明疏水性增加。这表明，设计的氧化铯钨-荧光碳点可以很容易地用于检测涂层表面上的细菌。图b)显示了存在和不存在不同浓度细菌的情况下涂层表面的荧光图像。在两种细菌的存在下，涂层表面的蓝色荧光发射显著降低≥105 cfu/mL，而浓度<105 cfu/mL的涂层表面继续显示出显著的排放，并且与没有细菌的涂层表面相比，仍然发生猝灭现象。

  如图所示，从氧化铯钨-荧光碳点纳米结构处理两株菌株后的SEM图像可以看出，近红外照射前的菌株表面光滑，当进行近红外照射后，细菌表面被光热分解破坏。

  基于电化学的无线细菌传感系统

  图5a)显示，荧光碳点和氧化铯钨-荧光碳点涂覆的硅晶片相对于裸硅晶片和聚合物涂覆的硅晶片显示出更低的电阻值，表明荧光碳点和提高了氧化铯钨涂覆表面的导电性。图5b)和c)显示，氧化铯钨-荧光碳点涂覆的硅晶片与细菌孵育显著增加了电阻值，因为细菌附着在涂覆表面上。此外，在分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育(P<0.01)后，经过和未经洗涤的细菌处理的涂层表面之间观察到抗性差异，这种现象的发生是由于在洗涤之前未附着的细菌残留在表面上，而在洗涤之后，未附着的菌被从表面去除，导致抗性降低。

  如图所示，该图为不同菌浓度下涂覆在硅表面上氧化铯钨-荧光碳点的电化学阻抗谱，图a)和b)中显示了与传感器表面细菌数量增加相对应的电阻的显著差异。这些结果表明，细菌浓度的增加对应于更多的细菌细胞附着在表面，这对电子转移产生了更大的阻断作用。

  基于智能手机的电化学无线传感器

  基于传感器对不同细菌浓度的电化学响应，我们设计了一种电子无线传感器来跟踪细菌的存在。图a)说明了使用该无线设备进行细菌检测的简单概念。氧化铯钨-荧光碳点涂层硅晶片连接到蓝牙模块和微控制器。通过激活蓝牙连接，微控制器将细菌存在时生物传感器电阻的变化直接传输到智能手机，从而实现实时细菌检测;图b)展示了无线系统的完整设置，该系统包括智能手机(接收器)、涂覆硅晶片和电路之间的连接器以及包括蓝牙棱镜和微控制器的电路;图c)为连接到设备后，在智能手机显示屏上监测细菌的存在(显示为电阻图)，由图中可知，智能手机的信号输出与电化学信号一致，表明基于电化学的细菌传感系统可以与无线设备相结合，直接向智能手机提供细菌检测的实时结果。

  结论

  1、描述了一种表面可涂布、近红外响应、电化学生成的氧化铯钨-荧光碳点纳米杂化物的设计和评估，用于溶液和表面固体上基于无线电化学和荧光的细菌检测。

  2、该生物传感器利用邻苯二酚将氧化铯钨纳米颗粒固定在荧光碳点上并作为粘合剂表面涂层剂，使用荧光猝灭和由于荧光碳点的阳离子和细菌细胞壁上阴离子之间的相互作用而发生的电阻变化来实现细菌检测。

  3、基于荧光检测对大肠杆菌的检出限为70 CFU/mL，对金黄色葡萄球菌为131 CFU/mL，而电化学方法更为敏感，两种细菌菌株的检出限均小于10 CFU/mL。

  4、电化学方法被扩展为允许实时无线细菌传感，结果直接显示在智能手机上。

  5、由于存在近红外响应的氧化铯钨纳米颗粒，纳米杂化物在近红外照射下表现出出色的杀菌能力，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效率几乎为100%。

  6、这种氧化铯钨-荧光碳点纳米杂化物可用于使用荧光或电化学方法同时检测和杀死溶液中和涂层表面上的细菌。

  参考文献

  Robby, A. I., Kim, S. G., Lee, U. H., et al. (2021). Wireless electrochemical and luminescent detection of bacteria based on surface-coated CsWO3-immobilized fluorescent carbon dots with photothermal ablation of bacteria. Chemical Engineering Journal, 403, 126351.