摘要：细菌感染是一个日益严重的公共卫生问题，并造成了巨大的医疗和财政负担。高效地构建多功能细菌护理点检测(POCT)和消除平台具有重要意义。在此，合成了具有高效光热转换的近红外(NIR)光响应万古霉素掺杂普鲁士蓝纳米颗粒(PB-VANNPs)，用于结合、双模便携式检测和消除细菌。万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒可与革兰氏阳性细菌的表面结合，形成万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/革兰氏阳性菌复合物。离心后，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的上清液可以在NIR照射下促进全氟己烷(PFH)快速释放氧气(O2)。因此，使用便携式压力计作为信号读取器可以灵敏地检测细菌，检出限(LOD)为1.0 CFU/mL。离心后的沉淀物万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/细菌可以通过热摄像机检测到，报告的检出限为1.0 CFU/mL。有趣的是，在基于温度的检测过程中，随着局部温度升高，细菌可以被有效地灭活。抗菌效率高达99.8%。所开发的多功能纳米平台不仅为便携式检测细菌提供了一种简单的“混合式测试”方法，而且还实现了同时高效消除细菌。所开发的策略进一步应用于促进细菌感染小鼠的伤口愈合。

  多功能纳米平台的原理

  图中显示了多功能纳米平台的原理，图中可以看出通过整合掺杂万古霉素的普鲁士蓝纳米颗粒，构建了基于便携式压力计和热相机的近红外(NIR)光触发纳米平台，以实现细菌结合和双模态护理点检测。该平台利用万古霉素能够特异性结合革兰氏阳性菌的特性，通过离心后，将分离的上清液与留下的沉淀分别进行信号检测。其中，上清液的信号转换是通过万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒在NIR照射下后，导致温度升高，从而触发全氟己烷(PFH)快速释放氧气(O2)，而用压力计进行检测的。另一方面，沉淀物万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/菌复合物也会在NIR照射下导致温度升高，在热成像机进行测量后，作为第二模式的检测信号。此外，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒会通过光热效应将目标菌灭活，这有利于防止致病菌的二次污染。本研究以金黄色葡萄球菌为模型菌，体现出了良好的应用效果。

  万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的表征

  图(A)显示了万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒SEM图像，图中可以看出万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒具有典型的立方体形状。图(B)显示为万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的平均横向尺寸为192.2 ± 9.0 nm。图(C)为高角度环形暗场扫描TEM图像和EDX 元素图，图中显示了Fe、C、N和O元素的均匀分布。Fe元素来源于普鲁士蓝纳米颗粒，O元素来源于万古霉素，由此表明了万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的成功制备。图(D)为zate电位图像，图中显示为普鲁士蓝纳米颗粒和万古霉素分别显示出负电荷和正电荷，由于普鲁士蓝纳米颗粒与万古霉素之间的中和反应，普鲁士蓝纳米颗粒比普鲁士蓝纳米颗粒-万古霉素电位更负，这进一步证实了普鲁士蓝纳米颗粒-万古霉素的成功制备。

  万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的光热性能

  由于NIR范围中的高吸收率和光热转换效率，普鲁士蓝纳米颗粒已被广泛用作新一代NIR激光驱动光热剂，用于癌症治疗和抗菌应用。在用万古霉素掺杂后，图(A)可以看出万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒仍然表现出与普鲁士蓝纳米颗粒相同的700至900 nm的吸收峰，这意味着万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒中的电子在吸收NIR光后具有明显的等离子体共振效应。因此，它可以产生显著的光热效应并加热周围介质，导致温度升高。图(B)和(C)分别对应于温度图和相应的定量温度分析图，图中显示为在NIR(808 nm)照射下，没有万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒就没有检测到明显的温度变化。在万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒存在下，溶液的温度随着万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的照射时间和浓度的延长而升高。图(D)表明所制备的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒可以抵抗长期激光照射，溶液的最高温度在四个加热和冷却过程循环后没有明显变化，这表明了纳米颗粒具有优异的光热稳定性。所有结果表明，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒保持优异的光热效应，并在光控制生物分析中显示出巨大的潜力。

  基于气体压力的细菌检测

  我们首先关注以全氟己烷作为气体供体的基于压力的细菌即时检验。众所周知，由于它们之间的范德瓦尔斯力，全氟己烷对O2具有高亲和力，随着温度升高，这种亲和力会减弱。因此，当温度升高时，O2可以从全氟己烷中快速释放，这通过记录NIR激光照射下的实时压力来验证。图(A)为不同条件下体系的压力变化，其中a，b，c，d分别为体系中加入只全氟己烷组分，全氟己烷在NIR激光照射后的组分，全氟己烷+万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒不用NIR照射的组分和全氟己烷+万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒在NIR照射后组分的压力变化，图中可以看出，只有全氟己烷+万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒在NIR照射后才会出现明显的压力变化。对应的i，ii，iii组分也并没有气泡产生，只有iV组分产生了气泡。最后，在V中我们发现NIR照射5分钟后全氟己烷和万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒混合物的热成像温度明显升高。图(B)显示为不同浓度万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒加入到全氟己烷(4%)溶液后的压力变化，图中可以看到，压力变化(ΔP)随着万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒浓度的增加而增强，并且在万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒浓度达到100 μg/mL时，平台的O2生成变为饱和。因此，浓度为100 μg/mL的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒用于基于压力的细菌检测。对于细菌检测，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒首先与金黄色葡萄球菌一起孵育，由于万古霉素与细菌之间的相互作用，生成万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/金黄色葡萄球菌混合物。然后通过离心从上清液中分离混合物，在将全氟己烷加入到含有剩余万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的上清液中后，在NIR照射下，残留的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒会升高溶液温度，引发全氟己烷中O2的释放，导致气体压力变化。细菌浓度越高，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的残留量越少，导致压力(ΔP)的变化越大。如图(C)所示，平台获得了从102 CFU/mL到106 CFU/mL的金黄色葡萄球菌浓度的线性压力变化，检出限为1 CFU/mL，证明了基于压力变化的金黄色葡萄球菌的即时检测平台具有高灵敏度。

  基于温度变化的细菌检测

  图中为离心后沉淀物万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/菌混合物的温度信号，图(A)为万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒/菌混合物的SEM图像，图中可以看出，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒能够吸附在金黄色葡萄球菌的表面。随着细菌浓度越高，吸附的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒越多，在NIR照射下的温度越高。图(B)可以看出，温度与金黄色葡萄球菌浓度呈线性关系，范围为101 CFU/mL至106 CFU/mL，检出限计算为1.0 CFU/mL，表明成功制备了基于温度的高灵敏度金黄色葡萄球菌即时检测平台。

  万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的体外抗菌能力

  近年来，光热治疗因其可以减少抗生素的使用而吸引了越来越多的细菌杀灭兴趣。此外，近红外吸收光热疗法受到广泛关注，因为生物组织在该光谱区域的低散射和低吸收，以及较长的穿透深度，这对周围组织的影响较小。图(a)和(b)分别为荧光活菌染色法评估万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的灭活效果，其中钙黄绿素AM的绿色代表活菌，PI的红色代表死菌。图(a)中可以看出，在NIR处理前，荧光染色为绿色，细菌表现出优异的活性。而图(b)表示细菌在NIR处理后，荧光染色为红色，表明被捕获的细菌被万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒光热灭活。图(c)显示为在没有NIR照射时，平板上出现大量的细菌菌落，图(d)为当加入NIR光照但没有加入万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒时仍会出现大量的细菌菌落，图(e)显示为无NIR照射的条件下，加入万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒仍会出现大量的细菌菌落，图(f)显示为在万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒和NIR协同作用下，平板上只出现零星的菌落。图(g)和(h)分别显示为万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒有无NIR照射下的SEM图，图中表明只有NIR与万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒协同作用，SEM上的细菌才会出现破裂现象。

  万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的体内抗菌应用

  为了进一步证明所制备的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒的体内抗菌应用潜力，图(A)显示为将感染金黄色葡萄球菌的小鼠用作模型，在伤口部位滴注万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒来进行治疗。图(B)为分别利用PBS缓冲液、万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒作为对照组，在NIR照射下利用万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒对小鼠伤口的治疗处理作为治疗组，图中可以看出，在治疗的五天内，对照组的整个感染过程中出现了明显的溃疡和渗出物形成，而NIR治疗组中小鼠的瘢痕形成和伤口愈合更快。此外，使用H&E染色对伤口组织进行的组织学检查表明，在对照组中，第五天仍可区分正常组织和伤口之间的边界，而在治疗组中具有完整真皮层的疤痕消失。图(C)为在标准化伤口面积比较的基础上，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒在NIR照射下的伤口面积显著减少(10%)，而对照组在治疗5天后超过30%，表明在NIR的照射下，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒能够使组织再生的更好。图(D)显示为不同条件处理后的平板计数情况，图(E)对应于PBS、万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒和万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒+NIR三组治疗第五天时存活的金黄色葡萄球菌数量，图中可以看出，万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒+NIR的组分的细菌数量明显减少，表明万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒通过NIR照射后具有优异的抗菌效果。图(f)表明，在治疗过程中，小鼠的体重没有明显的变化。

  总结

  1、已经成功地制造了多功能万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒纳米平台，以通过便携式压力和温度监测器实现细菌结合、双模现场即时检测以及在NIR控制下的光热消除。

  2、所制备的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒具有优异的光热转换能力，能够高效地从全氟己烷中释放O2，报告检出限低至1 CFU/mL。该检测非常简单和方便，在没有过氧化氢的情况下仍能使用压力计作为信号读取器。

  3、固定在细菌表面的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒赋予其光热细菌检测能力。检测限达到1.0 CFU/mL，这比以前的大多数报告更灵敏。

  4、细菌可以在两种便携式模式下进行检测，提高了检测精度。该方法可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，具有灵敏度高、成本低、检测简单等优点，在即时检测中具有巨大的应用潜力。

  5、开发的万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒具有优异光热性能，可以在检测过程中消除结合的细菌，显示出高效的抗菌性能。万古霉素-普鲁士蓝纳米颗粒作为光热剂可以有效地促进细菌感染小鼠的伤口愈合过程。该新型平台与双模式检测和消除细菌相结合，避免了细菌的二次污染，在未来具有巨大的应用潜力。

  参考文献

  Hao, Z., Lin, X., Li, J., et al. (2021). Multifunctional nanoplatform for dual-mode sensitive detection of pathogenic bacteria and the real-time bacteria inactivation. Biosensors and Bioelectronics, 173, 112789.