三维膜状SERS纳米贴在双通道横向流动免疫分析条上对四种致病菌的超灵敏和多重检测

  背景：基于快速色谱分离和抗体-抗原特异性识别的横向流动免疫分析(LFA)已发展为最受欢迎的护理点检测(POCT)技术，具有低成本、便携性、用户友好性和实时分析的显着优势。传统的LFA方法依赖于基于胶体金(AuNP)的比色信号，通常表现出定性或半定量能力，灵敏度有限。幸运的是，通过引入荧光、化学发光、磁性和拉曼信号等新的信号模型，LFA系统的灵敏度和准确性得到了极大的提高。此外，LFA通过在纸条上设置多个测试区来支持多通道分析。在过去四十年的不断发展中，LFA生物传感器已广泛应用于人类健康监测和食品安全控制，可实现毒素、农药、蛋白质、核酸、外体、病毒等各种生物和化学分子的敏感和多重测定。然而，LFA技术在直接检测细菌方面仍面临三大挑战。首先，与LFA的硝酸纤维素(NC)膜孔径(一般为6-15 μ m)相比，细菌细胞尺寸过大(一般为0.6-5 μ m)。虽然大孔NC膜(孔径>12 μ m)可以提供宽阔的细菌通道，也减少了细菌的数量细菌-纳米标记免疫复合物在测试线上形成，结果在削弱灵敏度的分析。二是常用的纳米标签LFA主要为球形胶体纳米粒子(NPs)或复合纳米粒子球，它结合在细菌的表面，从而增加形成的细菌-纳米标签复合物的大小和削弱它们的可分散性。第三，真实细菌样品(如临床标本、食物基质)中复杂的成分(如酸、高盐、蛋白质、细胞片段)容易影响传统LFA纳米标记的胶体稳定性，产生无效甚至错误的结果。目前开发的LFA检测方法灵敏度低(一般为>100 cells mL−1)，通量低(≤2)，检测细菌的通用性差。

  表面增强拉曼散射(SERS)是一种强大的振动光谱技术，可以显著增强吸附在贵金属纳米材料上的分子的拉曼信号，为目标定量提供超强(单分子水平灵敏度)、特异性(指纹谱)和稳定(无光漂白)的光信号。SERS纳米标签是SERS-LFA的关键成分，它决定了SERS-LFA检测的灵敏度和稳定性。虽然许多种SERS纳米结构，如球形AuNPs，Au@AgNPs, SiO2@Au，Fe3O4@Ag/Au和含纳米间隙的AuNPs已被提出用于免疫传感器，但用于细菌检测的理想标记尚待开发。

  方法：首先，首次提出了膜状三维SERS标签，并将其引入到LFA系统中，以取代常见的球形标签用于细菌检测的SERS纳米标签。抗体标记的GO@Au/Ag标签可以高效、紧密地覆盖在细菌表面作为纳米贴纸，不仅能提供更强的SERS信号，还能促进细菌-纳米标签配合物的流动性，从而提高LFA检测病原体的灵敏度和多路性。第二，两个拉曼染料分子，包括5,5 ' -二硫代铋-利用(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和4-巯基苯甲酸(4-MBA)制备GO@Au/Ag纳米贴，提供不相交的拉曼峰，在两条试验线上同时检测4种细菌。该策略有效地提高了LFA方法的检测吞吐量，并显著缩短了SERS信号评估时间和整个检测时间。

  Figure 1. Schematic diagram of (a) synthesis of 3D GO@Au/Ag SERS nanosticker, (b) preparation of immuno-GO@Au/Ag SERS labels, and (c) mechanism of GO@Au/Ag-based SERS-LFA for multiplex detection of four bacteria.

  结果：基于GO@Au/Ag的SERS-LFA可同时定量检测4种主要致病菌:伤寒沙门菌、大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌在20分钟内，检测限(LODs)低至9 cell mL−1。在真实的临床样本(即人类尿液和血液)中验证了该技术的高准确性、特异性和潜在的实际应用。该方法为真正实现LFA带材上细菌的多重、灵敏检测提供了新的思路和有效的解决方案。

  Fig. 5. (a) Photographs and corresponding SERS mapping images of GO@Au/Ag-based SERS-LFA for simultaneous detection of S. typhi and E. coli on the T2 line and S. aureus and L. mono on the T1 line. (b) Detection results of AuNP-based LFA method for four target bacteria. The average SERS spectrum of (c) T2 lines and (f) T lines for different concentrations of four bacteria (106 –0 cells mL−1). Corresponding calibration curves of (d) S. typhi, (e) E. coli, (g) S. aureus, and (h) L. mono.

  参考来源：Wang C, Wang C, Li J, et al. Ultrasensitive and multiplex detection of four pathogenic bacteria on a bi-channel lateral flow immunoassay strip with three-dimensional membrane-like SERS nanostickers[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2022, 214: 114525.