快速、直接、可视化和无抗体的细菌检测，具有额外的物种识别和敏感性评估能力

  摘要：抗生素滥用导致的细菌抗药性(AMR)是一个全球性的突出挑战，需要一种快速、经济和可推广的细菌检测技术。在这里，在尿道感染(UTIs)的情况下，设计了一个裸眼、无抗体和多功能细菌评估平台，该平台由刀豆蛋白a修饰的金纳米颗粒(ConA-AuNPs)、万古霉素修饰的金纳米粒子(Van-AuNPs)和多粘菌素B修饰的普鲁士蓝纳米粒子(PMB-PBNPs)组成。基于伴刀豆球蛋白A诱导的细菌细胞快速凝集，ConA-AuNPs可以在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌细胞上聚集，在30分钟内由于表面等离子共振性质的改变而导致可见的颜色变化。此外，由于万古霉素和多粘菌素B对细菌的亲和力不同，Van-AuNPs优选与革兰氏阳性细菌结合，在2-3小时内产生比色反应;而PMB-PBNPs可以通过先前的革兰氏阴性细菌代谢而减少无色普鲁士白(PW)，而革兰氏阳性细菌代谢在4–6小时内减少。将我们的平台与抗生素结合，可以在4–8小时内确定细菌的最低抑制浓度，这通过将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与各种抗生素孵育来证明。临床样本验证了可行性，仅在经典临床试验时间的1/48就可以达到一致的结果。因此，该比色纳米平台有序地实现了细菌的快速检测、物种鉴定(革兰氏阳性和革兰氏阴性)和敏感性评估，满足了从及时临床诊断到准确用药指导的多重需求。

  图1多功能纳米平台的检测原理及应用

  图中为多功能纳米平台的检测原理，如图A所示，所设计的传感器具有三种功能：I：快速诊断细菌(30分钟)，II：革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的细菌鉴定(2–6小时)和III：抗微生物敏感性测试(4–8小时)。图B中可以看出，基于万古霉素对革兰氏阳性菌的特异性识别，多粘菌素B对革兰氏阴性菌特异性识别，开发具有鉴别革兰氏阴阳菌的鉴定平台。此外，本研究尝试改进传统的肉汤微量稀释法来测试抗菌药物的敏感性。将细菌与不同浓度的抗生素共培养一段时间后，分别添加刀豆蛋白A-金纳米粒子(ConA-AuNPs)、万古霉素-金纳米粒子(Van-AuNPs)和多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒(PMB-PBNPs)，从而实现对多重耐药性细菌的肉眼检测。图C为最优条件下刀豆蛋白A-金纳米粒子探针对不同浓度的大肠杆菌O157:H7的吸收光谱，从图E中可以看出，在600 nm/524 nm处的吸光度与大肠杆菌O157:H7浓度在105-108 CFU/mL时呈优越的线性关系。图D为刀豆蛋白A-金纳米粒子对在不同浓度的金黄色葡萄球菌存在时的吸收光谱，图F中可以看出在600 nm/524 nm处的吸光度与金黄色葡萄球菌浓度在105-108 CFU/mL时呈优越的线性关系。图G表现为当与金黄色葡萄球菌共培养时，万古霉素-金纳米粒子溶液变为灰色(105–108 CFU/mL)或紫色(104 CFU/mL)，紫外峰值随着强度减少而红移。此外，万古霉素-金纳米粒子探针对大量大肠杆菌时颜色和吸光度也有轻微但不同的反应(图H)。这可能是由外膜受损的死亡大肠杆菌细胞引起的，其中脂质II的D-Ala-D-Ala会接触到万古霉素-金纳米粒子，导致其凝集，从而导致颜色变化。多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒在孵育期间密切参与大肠杆菌的活性代谢过程，这会导致颜色从蓝色变为白色，吸收峰下降(图I)。图J中可以看出，金黄色葡萄球菌还导致普鲁士蓝纳米颗粒轻微变色，这可能是由金黄色葡萄杆菌代谢过程中产生的还原物质引起的。图K和图L表明万古霉素-金纳米粒子在600 nm/524 nm处的吸光度与金黄色葡萄球菌浓度在103-108 CFU/mL时呈优越的线性关系，多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒在600 nm/524 nm处的吸光度与大肠杆菌在103-108 CFU/mL时呈现良好的线性关系。图M为用层次聚类分析(HCA)和对其进行进一步处理，以分析革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间的差异。HCA生成的树状图显示了六个不同的聚类，每个聚类对应一种细菌。单个细菌群的距离表明了群之间的相似性。如树状图所示，大肠杆菌和铜绿假单胞菌(均为革兰氏阴性菌)均处于同一水平，而金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌被分为卷曲乳杆菌和格氏乳杆菌组，均为革兰氏阳性菌。图N为主成分分析(PCA)对单个细菌种类的万古霉素-金纳米粒子和多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒(来自三次平行测量)的吸收光谱进行PCA。两个圆圈簇(革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)没有交叉，描绘了革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的95%置信椭圆，表明万古霉素-金纳米粒子和多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒可以区分几种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

  图2快速抗生素敏感性测试

  细菌耐药性测试(AST)是指导临床用药的重要基础。作为细菌耐药性测试的标准方法，肉汤微量稀释法耗时(48–72小时)，需要精密仪器。本研究已经提供了基于复合纳米材料的AST的快速肉眼检测。氧氟沙星(Ofl)和环丙沙星(Cip)是一种广谱抗生素，通常用于治疗尿路感染，这会破坏细菌代谢活动，通过抑制细菌DNA制造过程导致细菌裂解。为了测试细菌对Ofl和Cip的敏感性，分别使用刀豆蛋白A-金纳米粒子和万古霉素-金纳米粒子(金黄色葡萄球菌组)以及刀豆蛋白A-金纳米粒子和多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒(大肠杆菌组)。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在Mueller Hinton肉汤(MH肉汤)中稀释至105 CFU/mL的浓度，然后用不同浓度的抗生素溶液(0–64μg/mL)处理2小时，添加复合纳米颗粒并孵育另一个不同的时间。由于抗生素对各种细菌具有不同的杀菌作用，并且用不同抗生素浓度处理的细菌的残留浓度非常不同，导致颜色随着抗生素浓度的变化而变化，因此可以通过肉眼颜色变化的转折点来估计最小抑菌浓度(MIC)。抗微生物敏感性通过相对吸光度变化(A−Ab)/(Ac−Ab)，其中A是实验组的吸光度，Ab是MH肉汤中单独纳米颗粒的吸光度，Ac是对照组的吸光度(图A和B)。而图C为比色试验(C-MIC)的MIC与传统肉汤微量稀释法(T-MIC)和CLSI(CLSI-MIC)标准参考值的比较。

  图3临床样本评估

  对比色平台在临床样品中的性能进行了评估，以评估其实际应用的潜力。如图A所示，收集了患者尿袋中的尿液。我们研究了来自10个阳性UTI和10个阴性UTI个体的尿液样本。与空白组相比，革兰氏阳性细菌感染的刀豆蛋白A-金纳米粒子和万古霉素-金纳米粒子的相对值降低，而革兰氏阴性细菌感染的相对值增加，同时多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒的相关值降低(图B)。值得注意的是，所有阴性尿液样本中的相对丰度几乎没有变化，表明所提出的策略在导致假阳性报告方面具有良好的安全性(图C)。与阳性样本的临床尿液常规测试和尿液培养数据相比，我们的检测结果基本可靠(图D)。然而，我们也发现了一些有趣的案例。快速细菌检测单元5号样本的阳性结果表明细菌感染。然而，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌鉴定单元没有显示出显著的信号。这一结果可能是由于样品中的细菌浓度低和大量红细胞造成的。

  结论

  1、我们构建了一个快速、准确、廉价和通用的UTI诊断平台，可以进一步鉴定革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，并测试抗生素敏感性。

  2、刀豆蛋白A-金纳米粒子可在30分钟内实现细菌感染的快速诊断，大大加快了临床检测的进度。细菌可在2-6小时内通过万古霉素-金纳米粒子和多粘菌素B-普鲁士蓝纳米颗粒分为革兰氏阳性和革兰氏阴性。此外，细菌耐药性测试与合成纳米材料的结合与传统方法和CLSI手册基本一致，满足了从及时临床诊断到准确药物治疗的各种需求。

  3、该方法中的裸眼LOD(104 CFU/mL)不仅可以满足临床检测标准(105 CFU/mL)，还可以避免假阳性结果。

  4、总体而言，这项技术有望在家庭、养老院甚至资源有限的偏远地区迅速普及，从而显著减少细菌感染以及滥用抗生素的危害。

  参考文献：

  Zhao, M., Cao, F., Chen, J., et al. (2023). Rapid, direct, visualized and antibody-free bacterial detection with extra species identification and susceptibility evaluation capabilities. Biosensors and Bioelectronics, 221, 114902.