Comprehensive reviews in food science and food safety：开发具有成本效益的细胞培养基的考虑

　　近年来，细胞培养肉的发展和创新迅速加速，因为它有助于减轻日益增长的世界人口的膳食蛋白质生产面临的问题。然而，目前仍存在着技术障碍，阻碍了培养肉的大规模商业化，其中许多肉类都与用于培养肌肉、脂肪和结缔组织细胞的培养基有关。虽然动物细胞培养基已经被使用和优化了大约一个世纪，但它并没有在设计时专门考虑到细胞培养肉的要求。目前动物细胞培养最常见的工业用途是生产治疗性单克隆抗体，其售价比肉类高出几个数量级。成功生产细胞培养肉需要成本最低的食品级培养基，可以调节大规模的细胞增殖和分化，具有可接受的感官品质，并且不含动物成分。从传统培养基应用的知识和参与肌生成和蛋白质合成的代谢途径中，可以得到获得这些质量的培养基配方的策略。此外，应用用于优化大规模微生物发酵过程的培养基，生产较低价值的商品化学品和食品成分的原理也可以具有指导意义。因此，本综述概述了目前对与培养肉相关的细胞培养基的理解。

　　1、肉类养殖生产的预期模式

　　在考虑开发用于培养肉生产的细胞培养基时，考虑培养基将如何影响产品加工是很重要的。当然，培养基的主要用途将是培养干细胞，并将其分化为肌肉、脂肪和结缔组织。然而，实现这一目标的方式将取决于所需的产品-要么是非结构化产品(例如汉堡或香肠产品)，要么是结构化产品(如鸡胸肉或牛排)。因此，分别考虑这两种情况是有指导意义的。

　　在这两种情况下，使用不同的细胞来源(如牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡、鱼)可能需要重新优化生长和分化培养基的独特配方。虽然目前还不清楚这些优化的培养基对于每个期望的生产阶段、方案和物种会有多不同，但它们可能涉及调节增殖和肌生成的不同浓度的信号物质。无论如何，所有的媒体都需要是食品级的，无动物产品的，和廉价的，以便开发和销售一种可行的养殖肉制品。

　　2、培养肉类生产的培养基成本目标

　　无论选择何种生产方法或目标产品，培养基成本都将对产品至关重要。因此，在考虑生产非结构化或结构化产品的商业过程的可行性时，考虑大规模用于细胞增殖和分化的培养基的预期成本是很重要的。不幸的是，关于所需的培养基配方的信息很少能被公开获得，这意味着基本上不可能真正描述培养肉培养基目前和未来的成本。这在很大程度上取决于从所需的培养基成分中去除或取代特定的、昂贵的生长因子和其他蛋白质的能力。然而，其他人已经开始深入研究培养肉培养基的理论成本降低潜力，尽管对这些过程的同行评审的技术经济分析很少，特别是那些关注培养基成分及其成本的分析。

　　有人建议，生产1公斤培养肉所需的培养基的成本可能低至约5.00美元(假设需要约23升)，这低于大多数传统肉类每公斤的平均成本。但是，请注意，这一估计是基于许多广泛的假设，应谨慎解释。这一估计也远低于目前商业细胞培养基的价格，这表明进一步发展至关重要，即使考虑到规模经济也是如此。这些数字考虑到培养肉将用湿细胞(产品)重量来衡量，而大多数现有的工业细胞培养产品是用干细胞重量来衡量的。当然，培养基成本只是产品总成本的一个组成部分，必须考虑，以达到一个可行的工艺和产品。

　　3、用于动物细胞培养的常见培养基配方及其用于培养肉类生产的问题

　　动物细胞培养是一种成熟的技术，用于生物医学研究和生物制药生产。与食品行业不同，这些行业的最终产品价值非常高，因此这就证明了大量的生产支出和最小的成本优化努力。然而，细胞培养的悠久历史已经产生了对细胞在体外的生长需求和一系列成熟的培养基配方的了解。动物细胞培养基包括细胞存活所需的一切物质，以及引起增殖所需的细胞行为所需的任何额外成分，如增殖、附着或过度生长。从根本上说，基本介质是由碳源和氮源组成的，如葡萄糖、谷氨酰胺等氨基酸;维生素和无机盐;生长因子等信号分子;以及缓冲液。有许多发表的研究和评论讨论了传统培养基的一般和特定方面;因此，本节的目标不是详细介绍培养基的每一个基本方面，而是描述传统培养基配方如何为培养肉应用的培养基开发提供信息。

　　(1)生物医学研究中常用的培养基

　　在生物和医学研究领域，细胞培养基通常被认为是不可或缺的。为了促进更容易的可重复性和可靠的科学控制，研究人员经常在具有不同细胞类型和培养方案的各种研究中使用相同的培养基配方。市面上有一系列基础培养基;它们通常提供细胞存活和生长所需的大部分基本成分，包括葡萄糖、氨基酸和维生素。传统上，基础培养基配方补充了复杂的动物来源成分(即血清)，这些成分提供许多微量营养物质和信号分子。

　　(2)抗生素在细胞培养基配方中的使用

　　在生物医学研究的细胞培养中，预防性使用抗生素也很常见，即使对培养的细胞产生固有的不良副作用。尽管在保持细胞培养不受细菌污染方面面临更大的挑战，但抗生素的缺乏已被证明可以更容易地适应无血清的培养基。此外，在培养肉类生产中使用抗生素可能会给对特定抗生素敏感的消费者带来一个问题，并可能导致耐抗生素细菌的增加-这两种情况都可能阻碍消费者对这些产品的接受。因此，培养肉类工艺设计排除了抗生素的标准使用，这是现有工业规模的动物细胞培养工艺的典型情况，如单克隆抗体生产。

　　(3)细胞培养基配方中常用的缓冲液

　　平衡盐和缓冲溶液构成定义介质配方的基础。它们在pH值和渗透压的调节中很重要，其次可能是一些营养矿物质的来源。培养基中的pH值和离子平衡需要模拟生理条件(通常在pH值7.4左右)，以获得最佳的细胞生长。历史上，磷酸盐缓冲盐水(PBS)一直是细胞培养的重要盐溶液。碳酸氢盐缓冲系统，结合环境二氧化碳，经常用于动物细胞培养，但这需要仔细监测培养环境中的二氧化碳浓度。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)是经典两性离子缓冲液之一，常用于补充碳酸氢盐系统的缓冲能力;它显示出高质量的缓冲性能和相对最小的细胞毒性。然而，它是一种昂贵的成分，通常是基础培养基配方的主要成本驱动因素。

　　因此，较便宜的缓冲剂，如TES或复杂成分(见下文)，可以在需要考虑缓冲能力的培养肉类培养基中进行测试。然而，与研究环境相比，工业培养过程允许更严格地控制二氧化碳浓度，仅使用较便宜的碳酸氢盐缓冲系统可能就足以控制pH。

　　(4)商业细胞培养基的稳定性

　　还必须考虑培养基成分的稳定性和消耗率。无论是由于光或热暴露、相互作用，还是生产过程中不同阶段的不同消耗率，培养基成分的浓度和活性都会有所不同。许多常见的培养基成分可能会受到过度的光和热暴露的不利影响。这意味着用于肌肉组织细胞培养的传统培养基通常不能进行热消毒;相反，它们通常被过滤或辐照，以理想地消除所有微生物。因为热在工业规模上灭菌可能是一个更有效的过程，应该考虑使用更热稳定成分的培养肉培养基，尽管这一想法尚未得到直接测试。热稳定的、已定义的无血清培养基已被开发用于其他细胞类型和应用，这为培养肉类可能存在的观点提供了可信度。

　　(5)培养基对培养细胞的感觉特性的潜在贡献

　　应该注意的是，培养基很可能会影响收获的肌肉的感官品质。从逻辑上讲，细胞上或细胞内的培养基残留物可能会赋予味道、质地或颜色。例如，谷氨酸和天冬酰胺是肉类鲜味成分的主要贡献者，这些氨基酸是一些细胞培养基中的成分。因此，这为培养基的制定引入了一个必须加以考虑的新维度。最近发表的一些具有初步感官测试的研究表明，实验室规模的栽培肉类原型具有可接受的感官特性，因此培养基的感官品质似乎没有得到及时的关注。然而，到目前为止，还没有研究专门调查培养基的感官效应，尽管随着行业的发展，培养基的这些感官方面将变得更加重要。

　　4、培养基中的营养来源

　　碳和氮利用的速率和模式受到可利用性、细胞外信号和细胞增殖状态的调节，以及氧气的可用性——另一种独立于培养基配方的关键营养素。培养肉培养基所需的微尺度成分满足细胞对维生素和无机离子的需求，但这些不太可能对规模培养基成本产生显著贡献，因此它们需要较少的讨论和调查。因此，本节将讨论碳和氮源的功能和成本降低潜力。

　　(1)细胞培养基中的碳源

　　碳水化合物、氨基酸和脂质是肌肉组织细胞代谢的基本类碳源。虽然各种碳基分子可以作为营养由微生物和动物在生物水平，大多数培养动物细胞缺乏生化能力的基本水平有效利用葡萄糖、谷氨酰胺和有限数量的其他氨基酸和脂肪酸。动物细胞可能利用替代的糖底物，如果糖、丙酮酸、麦芽糖和蔗糖，但通常这些物质的代谢效率明显低于葡萄糖，似乎不是细胞生长的最佳选择。同样地，虽然在培养基中为细胞提供一些脂肪酸可能会减少参与从头脂肪酸合成的代谢负荷，但大多数动物细胞不需要外来脂肪酸。在培养肉中具有潜在重要性的不同细胞类型——肌管、卫星细胞/成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和这些细胞的茎状前体-具有不同的代谢率和需求，来自不同感兴趣物种的细胞也一样。这就产生了对特定肉制品生产线中感兴趣的细胞类型的培养基配方的潜在需求;然而，细胞类型之间更微妙的代谢差异需要进一步阐明。

　　细胞利用多种碳源摄取机制，如转运体介导的摄取、受体介导的内吞作用和非选择性大胞吞作用。在摄取和磷酸化后，葡萄糖被用作多种代谢途径的底物，产生三磷酸腺苷(ATP)用于能量，并合成核苷酸、脂肪酸和氨基酸等生物分子。主要的分解代谢葡萄糖代谢途径包括糖酵解(以及随后的发酵或氧化磷酸化)和磷酸戊糖途径。通过谷氨酰胺分解，谷氨酰胺作为一种碳源，产生α-酮戊二酸，然后用于许多生物合成途径。

　　(2)细胞培养基氧化作用的考虑因素

　　氧作为碳源氧化磷酸化过程中的最终电子受体非常重要，培养肉培养基不断提供适当浓度的氧气以确保有效的碳代谢非常重要。在工业规模上，对氧气需求存在一些挑战。虽然生物反应器的工艺设计超出了本综述的范围，但值得注意的是，已经在现有的工业动物细胞培养应用中建立了高效的氧控制技术(如级联控制的应用)。

　　(3)细胞培养基中的氮源

　　谷氨酰胺和其他氨基酸可能作为氮源的作用最为重要。氮是功能和结构细胞分子的重要组成部分，即蛋白质和核苷酸。高氮合成代谢是增殖细胞氮需求增加的驱动因素。不同的动物物种需要不同的氨基酸(必需氨基酸)的营养来源，通常至少是组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。此外，据报道，一些细胞类型能够利用氨中的氮，但谷氨酰胺仍然非常重要，因为它可以被代谢成许多其他用于蛋白质组装的氨基酸。谷氨酰胺分解也是NADPH再生的一种模式——这是许多合成代谢途径所必需的还原剂——进一步强调了谷氨酰胺在细胞增殖中的重要性。谷氨酰胺分解可导致氨在培养基中积累，因此工业细胞培养中的动物细胞通常经过基因修饰，从谷氨酸中产生自己的谷氨酰胺。虽然基因修饰可以用于栽培肉类，但它最终可能不可能或不可取(从技术或消费者的角度来看)。因此，基于目前对动物细胞碳和氮源代谢的了解，在培养基中获得游离葡萄糖、谷氨酰胺和某些其他氨基酸来增殖培养的肌肉组织细胞似乎是必不可少的。

　　(4)影响碳和氮使用的代谢考虑因素

　　积极增殖的肌细胞(成肌细胞)是培养肉类生产所必需的，可以理解，具有独特的代谢活动和需求。目前对成肌细胞代谢的大部分理解都来自于对癌细胞的研究，因为癌细胞也同样是快速增殖的细胞。瓦伯格效应描述了癌细胞倾向于从糖酵解中获得大部分ATP，并允许大多数丙酮酸转化为乳酸，即使是在氧气充足的情况下。然而，这种效应并不局限于癌细胞;它是所有快速增殖的细胞的标志。葡萄糖代谢通过华宝效应而不是氧化磷酸化产生多种葡萄糖代谢物，这些代谢物对增殖细胞进行高生物合成和分裂的速率有价值。因此，用于培养肉类生产的培养基可能会刺激和支持瓦伯格效应，以促进肌肉细胞增殖。Warburg效应已成功地通过基因操纵和其他内在手段，如刺激缺氧诱导因子(HIF)和通过酪氨酸磷酸化抑制丙酮酸激酶M2亚型。这些发现提示了促进体外肌细胞增殖的其他方法，如调节培养基中的氧浓度。然而，许多控制华宝效应的刺激机制仍然难以捉摸，其在培养肉类中的潜在应用仍有待研究。

　　用于生物制药生产的常见动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)和小鼠骨髓瘤细胞系(Sp2/0.NS0)，已经被选择或修饰为高效的生长和代谢行为，这也是培养肉中理想的已经选择或修改了高效的生长和代谢行为，在培养肉类应用中也是可取的。

　　5、结论

　　显然，设计培养基以实现可扩展的、低成本的、高质量的培养肉制品仍然是一个复杂的挑战。成功可能需要仔细的培养基配方，并结合细胞和培养系统对这些新培养基的创新适应。继续的研究应该集中在发展如何理解如何通过更经济和更合乎伦理的手段来刺激控制肌肉细胞生长和分化的分子机制。这项研究既可以为更主流的生物医学研究提供信息和信息。然而，培养基和过程更有可能类似于大规模的微生物发酵过程，其中生产商品化学品和食品成分。总的来说，近年来培养肉类领域相对快速的发展和扩张，这为可以克服许多剩余的挑战提供了信心。

图1. 与培养肉培养基相关的肌生成调控过程综述

图2.复杂培养基的营养概况

图3.实验性优化方法

原文：O'Neill, Edward N et al. “Considerations for the development of cost-effective cell culture media for cultivated meat production.” Comprehensive reviews in food science and food safety vol. 20.1 (2021): 686-709. doi:10.1111/1541-4337.12678