CRISPR/Cas整合自组装双功能纳米花的生物传感平台用于肠炎沙门氏菌的双信号读出检测

食源性致病菌严重威胁人体生命和健康。目前，大多数基于CRISPR/Cas的生物传感器用于检测病原菌都依赖于单色荧光输出信号。虽然荧光测定具有较高的灵敏度和成本效益，但容易受到环境因素，缓冲液成分变化和仪器波动的影响，可能导致错误的阳性或阴性结果。相比于荧光信号输出，基于CRISPR/Cas的比色生物传感器具有可视化，操作简单等优点，有望用于直观、灵敏的病原菌检测，然而，其检测病原菌的灵敏度、选择性和多信号读出能力有待进一步提高。

近日，东北农业大学姜毓君和满朝新团队以硫酸铜（Cu²⁺）为无机组分，以血红蛋白（hemin，又称铁原卟啉）和绒毛膜促性腺激素（hCG）蛋白为有机组分，通过简单的自组装方法成功制备了双功能纳米花状纳米酶（BFNzyme）（图1A）。所制备的纳米花在酸性和中性条件下表现出优异的过氧化物酶（POD）样活性，能在H₂O₂存在下高效催化TMB氧化成蓝色的氧化TMB（TMBox）。此外，纳米花酶中含有的hCG使其能够被验孕试纸有效识别。受制备的多功能纳米酶的特殊特性启发，开发了一个CRISPR/Cas12a介导的基于多功能纳米酶介导的信号增强策略的双检测模式生物传感平台用于肠炎沙门氏菌的检测。如图1B所示，整个双读出模式生物传感平台包括四个步骤：靶标DNA的提取，LAMP扩增，CRISPR/Cas12a介导的靶标识别和信号转导，以及所制备纳米酶介导的信号输出。制备的纳米酶作为双信号探针，通过单链DNA连接至磁珠上作为CRISPR体系的切割底物。经过LAMP扩增后，在靶标存在的情况下，Cas12a在引导RNA（gRNA）的作用下捕获靶标并激活其反式切割活性，使其非特异性地剪切单链DNA连接子，从而使得纳米酶释放至溶液中。磁分离后，将游离的纳米酶加入到适量的TMB-H₂O₂比色反应体系中会发生TMB的氧化变色反应（图1C）。得益于纳米酶的性质，其不仅可以作为信号放大标签实现灵敏的比色信号输出，还可以通过与妊娠试纸条结合实现横向测流检测（LFA）信号输出。如图1D，释放的纳米酶引入商业化验孕试纸条，在T线能够产生明显的红色条带。整个检测过程大约需要95 min，包括DNA提取（20 min），LAMP（60 min），Cas12a剪切（10 min），比色或LFA检测（5 min）。

图1 多功能纳米酶介导的CRISPR/Cas12a双读出生物传感平台用于检测病原性细菌的示意图。（A）用于鼠伤寒沙门氏菌检测的过程；（B）纳米酶介导的比色检测；（C）纳米酶介导的LFA检测。

研究首先制备并表征了纳米酶。利用蛋白质与铜离子的相互作用，采用仿生矿化生长法制备了具有类过氧化物酶高效催化活性的纳米酶。在此生长过程中，hCG和hemin都可以与铜离子络合形成初级晶体成核位点，进一步为hCG-hemin纳米晶体的成核提供了位置，最终导致花状纳米结构的生长。多孔花状结构的纳米酶具有较大比表面积，有利于暴露hemin中更多的活性位点，提高纳米酶的催化活性和稳定性。通过SEM、TEM、EDS、XPS对制备的纳米酶进行表征，证明了花状微晶结构的形成（图2）。

图2 纳米酶的特性。a）纳米酶的合成过程；纳米酶的b）SEM；c）-e）TEM；f）-h）EDS元素映射；j）XPS光谱；k）Cu 2p的高分辨XPS谱图；i）Fe 2p的高分辨XPS谱图。

由于纳米酶的类过氧化物酶活性主要归因于hemin成分，而hCG成分在验孕试纸中起诱导颜色变化的作用。因此，对合成的纳米酶所需的hCG和hemin用量进行了优化。然后，采用TMB-H₂O₂显色反应体系考察了纳米酶的催化活性，环境耐受性，和贮存稳定性（图3）。

图3 纳米酶的类过氧化物酶催化活性。a）hCG浓度的优化；b）hemin浓度的优化；c）纳米酶介导的显色系统；d）纳米酶催化TMB比色反应的反应时间曲线；e）纳米酶反应时间曲线初始线性部分的放大图。选择60 s作为初始速率周期，经过线性回归分析，该周期的R²系数接近于1；f）温度对纳米酶和HRP催化活性的影响；g）不同浓度TMB的Michaelis-Menten动力学曲线；h）不同浓度TMB的Lineweaver-Burk图；i）储存时间对纳米酶和HRP的催化活性的影响。

之后研究考察了提出的基于CRISPR/Cas12a的双检测信号读出策略的可行性并优化了反应条件（图4）。结果表明，LFA和比色检测的最佳实验条件一致，获得的单链DNA的最佳长度为65 nt，纳米酶浓度为600 µg/mL。

图4 单链DNA连接子和纳米酶浓度对生物传感平台检测结果的影响。（a）建立的CRISPR/Cas12a平台用于LFA和比色检测的可行性；b）LFA和比色法下的可视化图像；c）LFA检测的单链DNA连接子的长度优化；d）LFA检测的纳米酶浓度优化；e）比色法中单链DNA连接子的长度优化；f）比色法中纳米酶浓度的优化。插图分别显示了LFA和比色法下的可视化图像。

对检测方法的分析性能进行评价，结果表明，该研究构建的生物传感检测平台具有更宽的线性检测范围和更低的检出限，在鼠伤寒沙门氏菌的检测中表现出优异的性能。为了进一步评价方法的适用性，将qPCR作为对照方法评价所建立方法的分析性能，结果表明，相比于qPCR，该研究具有更宽的线性范围和更低的检出限。同时，建立的方法具有较好的抗干扰能力。将建立的方法用于实际环境样本（选择湖水作为代表性样本）和乳制品样本（选择牛奶作为代表样本）的检测，能够获得令人满意的加标回收率。

图5 双读出CRISPR/Cas12a生物传感器分析性能性价及交叉反应。a）不同反应溶液的紫外可见光谱；b）基于比色检测目标菌的线性范围；c）基于LFA检测的T线的信号强度；d）T线信号强度的标准曲线拟合结果；e）比色传感的选择性研究；f）LFA检测的选择性研究。插图分别显示了LFA和比色法测定下的视觉图像。

总之，本研究使用hCG，hemin和Cu²⁺的混合物通过自组装策略制备纳米酶。制备的纳米酶能够在验孕试纸上提供强大的视觉信号，同时其具有的类过氧化物酶活性能够通过催化TMB氧化产生额外的比色信号。基于以上特点，成功开发了一种新型的双检测信号读出的CRISPR/Cas12a结合LAMP扩增的生物传感器。所构建的传感器具有优异的检测灵敏度（比色法检出限为1 CFU/mL，LFA检出限为10² CFU/mL）和特异性，在现场检测中显示出巨大的应用潜力。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134323