生物基水凝胶微球加速糖尿病伤口愈合

摘要：中性粒细胞胞外陷阱(NETs)严重阻碍糖尿病创面愈合。使用脱氧核糖核酸酶(DNase)或阳离子纳米颗粒破坏或清除NETs受到释放被困细菌、半衰期短或潜在的细胞毒性的限制。本研究证实糖尿病患者创面渗出液中NETs水平与创面炎症严重程度呈正相关。新型NETs清除生物基水凝胶微球“微笼”，称为mPDA-PEI@GelMA，是通过将甲基丙烯酰明胶(GelMA)水凝胶微球与阳离子聚乙烯亚胺(PEI)功能化介孔聚多巴胺(mPDA)整合而成的。这种独特的“微笼”结构设计用于非接触清除纳米颗粒和糖尿病伤口表面之间的NETs，最大限度地减少生物毒性并确保高生物安全性。NETs随着伤口渗出物被引入“微笼”，阳离子mPDA-PEI通过与cfDNA网结构的强结合亲和力将它们固定在“微笼”内。研究结果表明，mPDA-PEI@GelMA通过清除体内和体外的NETs，有效减轻了与糖尿病伤口相关的促炎反应。这项工作介绍了一种新的纳米颗粒非接触式净网清除策略，以促进糖尿病伤口愈合过程，在临床应用中具有潜在的益处。

图1. 中性粒细胞胞外捕集器(NETs)清除剂“微笼”mPDA-PEI@GelMA的合成过程及其在糖尿病小鼠伤口清除中的应用示意图。

纳米颗粒面临的一个重要挑战是其小尺寸和独特的物理化学性质。这些特性使它们具有高反应性，并能穿透生物皮肤屏障进入系统循环，潜在地导致意想不到的后果和不可预测的临床结果。在我们的研究中，我们通过采用GelMA水凝胶微球作为载体来解决这些挑战。这种策略为mPDA-PEI在伤口应用中创建了一个“微笼”，旨在延长其滞留时间并减轻潜在的细胞毒性问题。利用微流控技术制备了GelMA微球，产生了具有良好分散性和沉降性能的白色颗粒。利用微流控技术制备了直径约为200 µm的mPDA-PEI@GelMA微球。扫描电子显微镜（SEM）揭示了密集的三维网络结构，并显示了GelMA水凝胶微球内的mPDA或mPDA-PEI纳米颗粒的存在。而亮场显微镜进一步证实了它们随时间的生物降解性。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）提供了对mPDA-PEI成功固定在GelMA微球内的可视确认，表明了mPDA-PEI纳米颗粒在GelMA网络内的有效保留。这些全面的发现共同证实了利用带有阳离子PEI功能化的mPDA的GelMA微球成功合成了纳米颗粒型NETs-cfDNA清除剂“微笼”，这种创新方法展示了它在糖尿病性伤口治疗应用中的潜力，解决了与稳定性和生物相容性相关的问题。

图2. mPDA-PEI@GelMA的合成和表征。(A–C) mPDA的透射电子显微镜（TEM）图像，包括所选mPDA的放大视图，以及mPDA-PEI NPs的TEM图像。(D) mPDA和mPDA-PEI的Zeta电位。(E,F) X射线光电子能谱（XPS）调查以及C 1s、O 1s和N 1s的原子浓度。(G) mPDA和mPDA-PEI NPs的X射线衍射（XRD）图谱。(H–J) GelMA、mPDA@GelMA和mPDA-PEI@GelMA微球的扫描电子显微镜（SEM）图像，以及所选区域的放大图像（白色矩形）。白色箭头指示了GelMA水凝胶微球内的mPDA或mPDA-PEI纳米颗粒的存在。(K) Cy5-PEG标记的mPDA-PEI@GelMA的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，Z-stack扫描图像的叠加图和3D图像。

在成功制备了NETs清除剂“微笼”mPDA-PEI@GelMA后，我们启动了对其在伤口渗出物中清除cfDNA能力的全面评估。图3A生动地展示了mPDA-PEI@GelMA优越的cfDNA清除性能，超过了GelMA和mPDA@GelMA的效力。为了进一步验证其治疗潜力，我们调查了mPDA-PEI@GelMA对TLR激活的影响，确认了其免疫调节效应。利用HEK-TLR3、TLR8和TLR9报告细胞，我们将它们暴露于伤口渗出物和特定TLR激动剂_poly(I:C) dsRNA、ORN06 ssRNA和CpG DNA的组合中。图3B、C中引人注目的结果无疑表明，与GelMA和mPDA@GelMA相比，mPDA-PEI@GelMA对由伤口渗出物及其相应的核酸配体诱导的TLR 3、8和9的激活具有优越的抑制作用。此外，mPDA-PEI@GelMA的免疫调节能力得到了证实，通过在RAW264.7细胞对CpG DNA的反应中显著减少炎症细胞因子的释放，如图3D所示。

图3. mPDA-PEI@GelMA阻断了体外糖尿病伤口相关TLR的促炎反应

过度的氧化应激，主要由反应性氧化物（ROS），如过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（•OH）和超氧阴离子（•O²⁻）引起，在糖尿病性伤口的细胞损伤中起着有害作用。这种氧化应激不仅损害皮肤细胞的存活，还诱导了促炎性的巨噬细胞表型，维持了慢性促炎环境，阻碍了自然的伤口愈合过程。鉴于在糖尿病性伤口管理中解决氧化应激的重要性，ROS清除策略已经成为有希望的治疗方法，其中PDA作为一个值得关注的候选物。PDA富含酚和儿茶酚等还原基团，具有出色的氧化还原能力，并通过捐赠自由基电子作为有效的ROS清除剂。特别是mPDA NPs，以其增强的活性位点可及性而备受关注。为了评估它们的自由基清除能力，我们将样品的UV−vis吸收与对照自由基溶液进行了比较。值得注意的是，mPDA-PEI在对•O²⁻和DPPH的清除能力上略逊于mPDA，这归因于PEI包覆后活性位点的丧失。然而，它仍以剂量依赖方式实现了约90%的清除率（图4A、B）。mPDA和mPDA-PEI对•OH的清除能力相似，并且呈剂量依赖趋势（图4C）。与GelMA微球的集成后，mPDA-PEI@GelMA对•OH、•O²⁻和DPPH的ROS清除效率略有降低，但仍保持了约70%的自由基清除率，超过了mPDA@GelMA和纯GelMA（图4D）。尽管反应条件严格控制，但由于正电性mPDA-PEl和GelMA微球之间的静电相互作用可能导致在中性条件下mPDA-PEI纳米粒子在GelMA内的浓度高于mPDA的负电荷，在这种情况下，mPDA-PEI@GelMA的ROS清除效率略高于mPDA@GelMA（图4D）。Rogust刺激的RAW 264.7细胞内mPDA和mPDA-PEI的ROS清除是完全的（图4E）。然而，在这些细胞内的mPDA@GelMA和mPDA-PEI@GelMA的效率显著降低，这可能是由于mPDA和mPDA-PEI从微球中释放到细胞内的减少。这些结果共同表明，NETs清除剂‘微观笼’在ROS清除方面也是有效的，进一步突显了它在伤口治疗应用中的潜力。

图4. mPDA-PEI@GelMA的ROS清除效率

基于 mPDA-PEI@GelMA 在体外表现出优越的 ROS 清除效率，从而调节炎症反应、中性粒细胞极化和 NETs 形成，我们进行了体内评估，以评估其在糖尿病伤口愈合中的功效，采用糖尿病全层皮肤缺损模型（图 5A），使用连续腹腔注射链脲霉素（STZ）建立了糖尿病小鼠模型，直至血糖水平超过 16.7 mmol L−1。图 5B 描绘了手术后 0、3、7 和 12 天的全层皮肤伤口愈合进程。在整个愈合过程中，没有观察到严重感染，在各组之间观察到不同的愈合速度和情况。值得注意的是，用 mPDA-PEI@GelMA 处理的伤口在每个时间点都显示出明显加速的愈合过程。到第 7 天，对照组的伤口仍然湿润，出现不完整的痂皮和渗出物，而用 GelMA、mPDA@GelMA 或 mPDA-PEI@GelMA 处理的伤口显示出明显的干燥和痂皮形成，这可能是由于 GelMA 水凝胶微球对分泌物吸收能力优越，有助于伤口表面干燥。12 天后，mPDA-PEI@GelMA 组显示出近乎完全的伤口闭合，与对照组、GelMA 组和 mPDA@GelMA 组相比，伤口面积更小（图 5B，C）。这表明了 mPDA-PEI@GelMA 的增强型愈合能力，优于其他组。

图5. mPDA-PEI@GelMA对糖尿病伤口愈合的影响

组织学分析，包括HE染色，为对伤口愈合的生物学效应提供了进一步的见解（图5D）。mPDA-PEI@GelMA组在重塑过程中表现出更快的再上皮化和肉芽组织形成，与其他组相比，显示出更丰富和更好状态的肉芽组织。此外，mPDA-PEI@GelMA伤口在第12天显示出新的肉芽组织和复杂的表皮结构，包括皮肤附属物样的组织。值得注意的是，水凝胶微球整合到新的皮肤组织中，而不引起明显的炎症反应，验证了它们在伤口修复中的安全性和有效性。

总结：

本研究记录了糖尿病患者伤口渗出物中NETs水平升高的情况，并建立了与炎症指标的相关性。引入了一种专门用于伤口的水凝胶微球，称为NETs清除剂‘微囊’ mPDA-PEI@GelMA，本研究旨在实现纳米材料与伤口表面之间的非接触性NETs清除，以增强伤口愈合。mPDA-PEI@GelMA通过清除NETs和ROS有效地缓解了与糖尿病性伤口相关的炎症反应。这种作用不仅缓解了慢性炎症，还加速了糖尿病小鼠模型中的伤口愈合。此外，mPDA-PEI@GelMA在糖尿病性伤口内对中性粒细胞系统表现出调节作用，显著抑制了中性粒细胞的N1表型和NETs的生成。因此，mPDA-PEI@GelMA成为治疗糖尿病性伤口愈合的一种新颖和有前景的选择。这种NETs清除剂‘微囊’的开发为创新的治疗方法在解决慢性炎症和推进糖尿病伤口护理领域方面开辟了途径。

参考文献：

Xiao Y, Ding T, Fang H, et al. Innovative Bio‐based Hydrogel Microspheres Micro‐Cage for Neutrophil Extracellular Traps Scavenging in Diabetic Wound Healing[J]. Advanced Science, 2024: 2401195.