抗生素作用下细菌形态学变化过程中蛋白表达突变的MALDI-TOF特征分析

AMR是一个严重的全球性问题，与人类发病率、高治疗费用和预防医院获得性感染的高支出密切相关。为了对抗耐药性，在分子水平上了解耐药性和寻找快速诊断的分子生物标志物至关重要。当使用抗生素治疗时，细菌通常的形态发生变化。例如，用β-内酰胺处理大肠杆菌时，细胞经历了四个过程：丝化、凸起形成、凸起停滞和裂解。丝化是细菌在抗生素药物影响下的一种生存机制和预期反应。当抗生素被移除后，细菌细胞的分裂可以恢复。在低浓度抗生素时，丝化的细菌细胞可产生耐药子细胞，该子细胞比亲本细胞具有更强的耐药性。形态学的变化与蛋白表达和/或蛋白翻译后修饰的突变有关，因而，鉴定抗生素作用下不同形态细菌的差异蛋白对于研究AMR机制至关重要。为实现这个目的，Zhang等人首先利用微流控芯片对抗生素作用下细菌形态进行观测，然后提取2种形态：杆状和丝状（~10⁵）下的细菌的蛋白，利用MALDI-TOF进行分析。通过将获取的峰谱与UniProt数据库匹配，大致找出可能的蛋白标记物。最后，再借助LC-MS/MS对这些蛋白标记物定量分析，对蛋白标记物进行进一步的筛选（图1）。

作者将耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CR-KP）、超广谱β-内酰胺酶类耐药大肠杆菌（ESBL-EC）、南美对虾副溶血弧菌61（VP-61）和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA）作为模型样本以说明所提出策略的性能。作为例证，CR-KP的研究数据将被详细展示。首先，作者构建了一个“圣诞树”形状的微流控芯片，此芯片可以形成梯度抗生素浓度，以此快速明确细菌形态变化的抗生素浓度。如图1所示，当头孢曲松浓度为1.67 mg/mL时，CR-KP形态从“杆状”变为“丝状”。当抗生素浓度高于1.67 mg/mL，细菌形态学变化不大，而细菌密度因细胞裂解而下降。通过对细菌进行计数，得到CR-KP的最低抑菌浓度（MIC，防止细菌可见生长的最低抗生素浓度），在1.67~2.22 mg/mL之间。基于此数据，作者用2 mg/mL头孢曲松处理CR-KP（在离心管中），以获得10⁵个“丝状”CR-KP；同时不添加抗生素培养，获得10⁵个“杆状”CR-KP。将这两种形态的细菌分别进行裂解获得其中的蛋白质，并进行MALDI-TOF分析，以此获得差分峰（图2）。将获得的m/z值与UniProt数据库中记载蛋白的分子量进行匹配，明确（62个）差分峰对应的蛋白质。通过数据库，仅匹配到42个差分峰（160个蛋白）。在160个蛋白中，有51个通过DDA LC-MS/MS鉴定，与MALDI-TOF质谱上的27个差异峰相关。在51个蛋白中，有10个与MALDI-TOF质谱上的13个差异峰相关的蛋白也通过DIA LC-MS/MS进行了定量，并在DIA LC-MS/MS和MALDI-TOF的信号强度上表现出相同的调控作用。在这10个蛋白中，8个与MALDI-TOF质谱上的11个差异峰相关的蛋白经LC-MS/MS鉴定含有＞1个独特肽，可以认为是潜在的生物标志物（图3）。其中，有3个蛋白已被报道为与细菌AMR相关。对于筛选出的这8个候选蛋白标记物，作者又进一步对其进行转录组分析，结果显示，有3个蛋白的mRNA的调控作用与数量变化相同，尽管转录组和蛋白组的相关性较低R²=0.41，这3个蛋白分别为：菌毛亚基3型、青霉素结合蛋白激活剂LpoB和30S核糖体蛋白S14。进一步，考虑到前2种蛋白已被报道为与细菌AMR密切相关，作者又研究了不同抗生素处理时间下这2种蛋白的数量变化。结果显示，2 mg/mL头孢曲松刺激0、1.5、3、4 h后，菌毛亚基3型蛋白的表达量随时间的增加而增加（图4 a），LpoB表达量则在1.5 h到3 h呈明显的下降趋势（图4 b）。背后原因可解释为：①菌毛亚基3型蛋白由MrkA基因编码，是3型菌毛结构的主要组成部分。MrkA促进了生物膜的形成，继而阻止药物分子通过生物膜，使细菌对抗生素耐受。②PBPs也可以影响细菌的耐药性。

总的来说，文章展示了一个较为详细的耐药蛋白标志物筛选流程：将微流控芯片与质谱结合进行蛋白质谱分析，以研究抗生素药物刺激细菌形态变化过程中蛋白质表达的突变。此策略筛选出了8个在头孢曲松刺激下CR-KP形态学变化的蛋白生物标志物，并通过LC-MS/MS的定量蛋白质组学方法进行了确认。在这8个生物标志物中，有3个通过了转录组分析验证，即菌毛亚基3型、青霉素结合蛋白激活物LpoB和30S核糖体蛋白S14。基于形态学变化挖掘出的这些蛋白（肽）标记物在未来进一步的验证研究后，或将有益于耐药菌耐药机制的研究；不过，当前利用质谱对细菌耐药性检测也是一大研究热点，是否这些蛋白标记物能够作为鉴定蛋白标记物，还有待验证。

图1 抗生素影响下细菌形态学变化过程中蛋白表达突变的研究方法

图2 （a）两种形态CR-KP提取的蛋白的质谱峰图（m/z范围为3000~18000）；（b-g）两种形态CR-KP的差分峰放大图，对应的m/z分别为7062、7569、10287、11260、11565、11766、15124。

图3 基于图2 MALDI-TOF结果进行与CR-KP形态学变化相关的蛋白生物标志物筛选的工作流程

图4 用MALDI-TOF MS检测2 mg/mL头孢曲松刺激下CR-KP细胞中蛋白表达水平随时间的变化，（a）为菌毛亚基3型，（b）为青霉素结合蛋白激活剂LpoB。

原文DOI: 10.1021/acs.analchem.8b05080