一种基于机器学习的比色传感阵列用于原料奶中各种耐药嗜冷细菌的快速区分

嗜冷细菌在乳制品原料奶中占比巨大。假单胞菌和不动杆菌最常从冷藏原料奶中分离出来，能够产生热稳定的蛋白酶和脂肪酶，使乳制品变质。此外，近年来抗生素的滥用导致嗜冷细菌变得耐药，对奶制品行业构成严重威胁。因此，在乳制品加工业中检测嗜冷细菌及其抗生素耐药性至关重要。

本研究开发了一种基于机器学习的快速、经济的比色传感器阵列来鉴定嗜冷细菌。由于其特定的代谢行为，传感器阵列还可以进行嗜冷细菌的抗生素敏感性测试（AST）。主要原理为：D-氨基酸修饰的Au纳米粒子与细菌孵育时，D-氨基酸从Au纳米粒子表面分离，并被细菌代谢成肽聚糖。金纳米粒子的稳定性受到干扰，积聚在细菌表面，溶液由红色变为蓝色。相应的，Au纳米粒子的吸收光谱峰从520 nm转移到了650 nm。依据不同细菌的不同代谢行为，最终在纯培养基和牛奶样品中实现了四种嗜冷细菌的良好区分。用不同浓度的抗生素孵育D-氨基酸修饰的Au纳米粒子和嗜冷细菌，构建了AST的快速检测方法。

研究首先分离了数百株嗜冷细菌，对其进行16s rRNA测序，并利用菌株之间的相似性确定各自的菌属，构建系统发育树。结果表明，假单胞菌、克雷伯氏菌、不动杆菌和黄杆菌是检出最多的嗜冷细菌。然后通过一锅反应合成了两种D-氨基酸（包括D-丙氨酸和D-谷氨酸）功能化的Au纳米粒子（图1A）。图1B和1E结果表明，相比于纯Au纳米粒子，D-氨基酸修饰后其等离子体吸收峰几乎没有变化。图1C和1F表明，合成的纳米粒子表现出典型的球形形貌，TEM图像显示直径约为3 nm。傅里叶红外光谱结果表明，合成的纳米探针中发现了几个独特的纯D-氨基酸峰，表明了D-氨基酸在Au纳米粒子表面的成功修饰。

图1 （A）D-氨基酸修饰的Au纳米粒子的合成示意图；（B）和（E）D-氨基酸修饰的Au纳米粒子和纯金纳米粒子的吸收光谱；（C）和（F）D-氨基酸修饰的Au纳米粒子的TEM光谱；（D）和（G）D-氨基酸修饰的Au纳米粒子的傅里叶红外光谱。

为验证比色传感器的原理，分别用D-丙氨酸和D-谷氨酸修饰的Au纳米粒子与10⁷ CFU/mL的细菌共培养，结果表明，在不含嗜冷细菌的纯TSB培养基中，探针孵育后仍保持红色，证明探针在TSB培养基中具有良好的稳定性。嗜冷细菌共孵育后，所有样品的颜色都发生了变化，吸收光谱发生了位移，在650 nm处吸光度增加，520 nm处吸光度降低。探究不同摩尔比的D-谷氨酸和D-丙氨酸混合合成的Au纳米粒子修饰的D-氨基酸的比色响应值，最终选择三种传感（D-丙氨酸修饰金纳米粒子、D-谷氨酸修饰金纳米粒子、D-丙氨酸修饰金纳米粒子与D-谷氨酸修饰金纳米粒子2:1混合）用于后续研究。采用基于650 nm与520 nm处吸光度比值的线性判别分析来显示比色传感器阵列的识别能力。通过记录探针与细菌共孵育12 h内的A650/A520值，观察到在培养6 h时，相应值达到峰值。与常规培养方法需要24 h才能找到清晰的菌落形态相比，比色传感器的检测时间明显缩短。

由于抗生素对细菌代谢行为的影响，导致Au纳米粒子聚集程度的变化，因此该探针可用于评估抗生素耐药性。在此之前，研究了各种抗生素对纳米探针的影响，由于吸收光谱无明显变化，说明单纯抗生素不会引起Au纳米粒子的聚集。然后将探针与嗜冷细菌在不同浓度抗生素下孵育，根据吸光度变化得到菌株耐药和敏感的浓度。方法与肉汤微量稀释法对4种嗜冷细菌的抗生素敏感性的测试结果一致，且检测仅需6小时，显著提高了检测效率。

为考察比色传感器阵列实用性，以巴氏牛奶作为实际样品进行分析。结果表明，方法的回收率可达94.5%-106.0%，相对标准偏差小于5%，说明构建的基于D-氨基酸功能化Au纳米粒子的比色传感器具有准确的检测能力，能用于原料奶中细菌的检测。进一步，将该传感阵列用于80个盲样检测，测试准确率达93.75%。

总之，本研究构建了一种基于D-氨基酸修饰Au纳米粒子的廉价、准确、快速的比色传感器阵列用于检测嗜冷细菌和AST。Au纳米粒子的聚集行为导致了不同的比色响应模式，反之又与细菌对D-氨基酸的代谢倾向直接相关。4种嗜冷细菌可在6 h内被鉴别出来，显著加快了检测进度，减少细菌感染和抗生素误用造成的危害。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.fochx.2024.101281