纳米酶驱动化学发光/荧光双模检测黄曲霉毒素B1

摘要：合成了一种新型的双功能MOF包封钴掺杂碳点纳米酶(Co-CD/PMOF)，具有优异的过氧化物酶催化活性和荧光特性，并用于制备AFB1检测的化学发光/荧光(CL/FL)双模免疫传感器。Co-CD/PMOF可以通过缓慢的扩散效应持续生成•OH、O₂^•−和¹O₂，催化鲁米诺/H₂O₂体系产生稳健且持久的CL信号。与传统的闪光型氯离子发射不同，这种发光型氯离子发射有助于制作灵敏、准确的氯离子传感平台。然后利用抗体功能化的Co-CD/PMOF作为信号扩增纳米探针，建立了AFB1的CL/FL双模检测方法。基于间接竞争免疫原理的CL模式分析在化学发光光纤平台上进行，采用AFB1-OVA功能化光纤探针进行生物识别、分离和信号传导。AFB1的检测范围为0.63 ~ 69.36 ng/mL，检出限为0.217 ng/mL。利用AFB1抗体功能化的免疫磁珠进行捕获分离，建立了基于三明治免疫原理的AFB1 FL模式检测方法。线性范围为0.54 ~ 51.91 ng/mL，检出限为0.027 ng/mL。本研究设计了一种灵敏、快速、可靠的纳米酶双模检测策略，为环境监测和食品安全领域提供了技术支持。

图1. Co-CD/PMOF的制造和表征。

图1A展示了使用简单的水热策略合成Co-CD/PMOF的方案。首先制备了PMOF，并将其用作封装Co - CDs的功能化接口。然后以CA、EDA和CoCl₂为前驱体，在PMOF的孔道内原位掺杂Co-CDs。图1B显示Co-CDs均匀分散，平均直径约为11 nm。与裸CDs相比，Co NPs的(111)晶面对应的间距为0.228 nm，表明Co元素的成功掺杂；图1C−E和图1F−H分别为Co-CD/PMOF的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)分析，表明Co-CD/PMOF呈典型的棒状结构，宽约 1 μm，长约4 μm，分布均匀。可以清楚地观察到Co-CDs掺杂在PMOF上，其中一些甚至聚集成大颗粒。通过对Co- cd /PMOF的能谱分析(EDS)(图1I)，可以清晰地观察到相应的C、Fe、O、Co、N、Zr等元素，进一步证明了Co- CD /PMOF纳米酶的成功合成。

Co-CD/PMOF催化和荧光性能评价：首先以鲁米诺和H₂O₂为底物对Co-CD/PMOF纳米酶的过氧化物酶样催化活性进行了评价。此外，还研究了CD、Co-CD和PMOF的催化活性。如图2A所示，首先记录60s内鲁米诺/H₂O₂体系的CL强度作为背景信号。当将Co-CD/PMOF溶液注入到CL衬底中时，会产生持久而强劲的CL发射产生的，其强度明显高于CD, Co-CD或PMOF。Co-CD/PMOF的这种催化特性有助于构建具有优异灵敏度、准确性和可重复性的纳米酶介导CL检测策略。与裸CDs相比，Co-CDs对发光氨CL反应没有明显的催化活性，而Co-CDs对CL反应的催化性能更强，这表明其优异的催化性能可能来自于掺杂的Co物质。不同于Co-CD/ 鲁米诺/H₂O₂体系的闪蒸型CL现象，PMOF可以诱导持久的CL信号。具有独特微孔结构的PMOF可以通过扩散效应促进CL底物从本体溶液缓慢进入Fe−N₄活性位点，从而延长CL的持续时间。Co-CD/ PMOF的制备使其具有最高的催化活性，其催化活性比POMF高近3倍。PMOF被用作Co-CD掺杂的功能化界面；丰富的Fe−N₄、Co−N₄活性位点和独特的扩散效应都是鲁米诺/H₂O₂体系长时间释放CL的原因。图2B考察了Co-CD掺杂量对Co-CD/PMOF催化活性的影响。随着Co-CDs掺杂量的增加，纳米酶诱导的CL信号显著增加。在所有制备的样品中，Co-CD1/PMOF的催化活性最高。随着Co-CD掺杂量的进一步增加，Co-CD/PMOF的催化活性下降，这是由于过量的Co-CD聚集在PMOF表面，阻塞了PMOF的活性位点和孔结构。

我们还研究了Co-CD/PMOF的荧光特性，如图2C所示。Co-CD/ PMOF的激发峰在350 nm左右，最大发射波长在450 nm左右。在紫外光(365nm, 2w)照射下，黄褐色的Co-CD/PMOF溶液产生了强烈的蓝色发光，这一特性可能是由于CD中含有丰富的酰胺类荧光团所致从图2D的结果可以看出，CDs和Co-CDs都产生了相似的FL发射，说明Co-CDs的FL来源于CD实体，Co掺杂对其发光性能的影响较小。Co-CD/PMOF的滤光性完全依赖于Co-CDs，因为裸PMOF对滤光性没有贡献。与Co-CDs相比，CoCD/PMOF的荧光强度明显降低，因为在相同浓度下，PMOF掺杂的Co-CDs远少于自由的Co-CDs。从图2E可以看出，CD、Co-CD和Co-CD/PMOF的荧光寿命几乎相同，说明掺杂PMOF后对Co-CD的荧光性能影响较小。Co-CD/PMOF的FL强度随着Co-CD掺杂量的增加而增加(图2F)。

图2 Co-CD/PMOF纳米酶的过氧化物酶模拟催化活性及FL特性评价。

检测机制及可行性分析：具有过氧化物酶活性和荧光特性的双功能Co-CD/PMOF纳米酶为建立AFB1双模荧光/荧光检测方法提供了可行的途径。利用AFB1抗体功能化的Co-CD/PMOF纳米探针(Ab-Co-CD/PMOF)进行信号传导(图3A)，基于间接竞争免疫亲和原理对AFB1进行化学发光检测。采用AFB1OVA抗原功能化光纤探针作为生物反应界面和CL换能器(图3B)。随着AFB1浓度的增加，与功能化光纤探针结合的Ab-Co-CD/PMOF减少，因为更多的Ab-Co-CD/PMOF的结合位点被AFB1靶点占据。在Ab-Co-CD/PMOF的催化下，产生与AFB1浓度相反的CL信号，然后通过COFP平台检测。

AFB1的FL检测基于夹心免疫检测原理(图3B)。采用AFB1抗体功能化磁珠(FMBs)作为捕获AFB1靶点的探针。Ab-Co-CD/PMOF还可以通过免疫亲和力与AFB1靶点结合。随着AFB1浓度的增加，形成的Ab-Co-CD/ PMOF/AFB1/ FMBs夹层结构增加。从而获得与AFB1浓度呈正相关的FL信号。

AFB1检测的典型化学发光动力学曲线及整个检测过程如图5C所示。首先对CL信号强度进行归一化，然后对AFB1浓度的对数进行拟合。根据图5D所示的剂量响应曲线，AFB1的动态范围为0.63 ~ 69.36 ng/mL，按照3倍标准偏差，检测限(LOD)为0.217 ng/mL。检测AFB1、赭曲霉毒素A (OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、蓖麻毒素及混合干扰物对应的CL强度，结果如图5E所示。上述干扰生物毒素对AFB1测定的影响可以忽略不计，说明CL模式法具有良好的选择性和抗干扰性。如图5F所示，随着AFB1浓度的增加，450 nm处的激发峰强度成比例增加。测定AFB1的检测范围为0.54 ~ 51.91 ng/mL, LOD为0.027 ng/mL(图5G)。图5H表明，制备的FL检测策略也具有良好的选择性和抗干扰性。

总结：

本文建立了一种新的双功能MOF包封钴掺杂碳点(Co-CD/PMOF)纳米酶驱动的CL/FL双模免疫分析策略，用于AFB1检测。Co-CD/PMOF具有优异的类过氧化物酶的催化活性，因为PMOF的支撑活性和多孔结构，提供了丰富的Co−N₄活性位点Co-CDs，以及充分暴露的Fe−N₄和Co−N₄活性中心之间的协同效应。缓慢的扩散效应和持续产生的•OH、O₂^•−和¹O₂是造成强而持久的辉光型CL排放的主要原因。分别采用抗体功能化的Co-CD/PMOF作为信号放大纳米探针与化学发光光纤平台结合或与抗体功能化的免疫磁珠结合，实现了AFB1的CL/FL双模检测。CL模式下，AFB1的检测范围为0.63 ~ 69.36 ng/mL，检出限为0.217 ng/mL。FL模式检测范围为0.54 ~ 51.91 ng/mL, LOD为0.027。我们的工作不仅制备了一种新型的双功能碳点掺杂MOF纳米酶，而且为AFB1的测量提供了一种灵敏、准确的双模式策略，这将探索一种多功能纳米酶驱动的环境监测和生化传感检测策略。

参考文献：

Yi Z, Xiao S, Kang X, et al. Bifunctional MOF-Encapsulated Cobalt-Doped Carbon Dots Nanozyme-Powered Chemiluminescence/Fluorescence Dual-Mode Detection of Aflatoxin B1[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024.