一种基于刃天青还原的分析方法用于2种临床重要非发酵菌的多粘菌素耐药性检测

碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（Pa）和鲍曼不动杆菌（Ab）是临床重点关注的多重耐药菌（ESKAPE）之二；PA和Ab是碳青霉烯类耐药菌中表现多重耐药性最为严重的病原菌。临床上，因多重耐药菌的治疗方案有限，其感染极易危及生命。当前，多粘菌素（粘菌素和多粘菌素B），被用作治疗多重耐药菌的最后一线抗生素。不过，在药物的使用过程中，Pa和Ab对多粘菌素的耐药性也在上升。因而，快速获得多粘菌素敏感性结果以优化抗生素管理是至关重要的。然而，目前测定革兰氏阴性菌对多粘菌素敏感/耐药的标准方法仍然是基于细菌培养的微量肉汤稀释（BMD）。此方法是临床进行药敏测试（AST）的金标准，能够获得相当准确的药敏结果，但是耗时（24-48 h）耗力；另外，此方法还存在一些技术问题，例如：多粘菌素的权重不正确、含多粘菌素粉末的活性可变及多粘菌素在对塑料制品的一些粘附作用（96孔板）等。其它的一些传统方法，比如纸片扩散法因其假阴性率过高并不被推荐用于多粘菌素的药敏测试。基于此，Mathilde Lescat等人开发了一个快速检测技术，名为Rapid ResaPolymyxin Acinetobacter/Pseudomonas NP test，应用于碳青霉烯类Pa和Ab对多粘菌素耐药/敏感的判定。事实上，已有研究报道了应用于肠杆菌科-多粘菌素NP测试，该试验工作原理是基于肠杆菌科葡萄糖代谢引起的基于pH的颜色变化。不过，这种多粘菌素耐药/敏感的可视化鉴定方案并不适用于非发酵菌：Pa和Ab。因而，本研究提出了新的NP测试，通过引入常用的细菌代谢指示剂：刃天青，和含有多粘菌素的MH培养基共同作为细菌生长基质，4小时后观察颜色完成Pa和Ab对多粘菌素的药敏判定（图1）。

作者共收集了92株Pa和Ab菌株，其中88来源于临床患者，4株来源于环境。通过BMD测试，43株Ab中有13株对多粘菌素耐药，49株Pa中有10株对多粘菌素耐药，详见表1。值得关注的是，这92株中的所有耐药株菌不含mcr基因（mcr-1和mcr-5）。为了说明方法的适用性，作者又进一步收集了32株肠杆菌，包括14株耐药（多粘菌素）大肠杆菌（n=16）、10株耐药肺炎克雷伯菌（n=11）、1株阴沟肠杆菌和12株耐药沙门氏菌。在这些肠杆菌株中，14株耐药大肠杆菌和4株耐药沙门氏菌携带了mcr基因。将上述所有菌株（包括敏感株）作为测试样本用于本研究开发的NP测试检测，结果显示：

① 在92株Pa和Ab中，有3株出现了耐药误判（敏感判定成耐药，Major error），无敏感误判（耐药判定成敏感，Very major error），也即敏感性100%，特异性97%。此外，所有阳性结果在添加刃天青后15 min到1小时内可以被观察到。因此，所有鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的分离结果在最多4小时内都得到了解释。

② 在32株肠杆菌株（其中28株耐药）中，检测的敏感性和特异性均为100%，所有18株产生MCR的多粘菌素耐药株均被准确判定。由此，本NP试验具备检测质粒介导的耐药性。

总的来说，本研究提出的NP测试表现良好，可作为肠杆菌科-多粘菌素NP测试的一个补充。本研究重在想法的创新，通过引入刃天青对细菌的代谢活性进行表征，以判定细菌的耐药（多粘菌素）性。本测试不仅可用于非发酵菌，对发酵菌（质粒介导耐药性）也同样适用。不过，本研究内容上不够详实，使用的菌株也有限，下一步可深入验证。

图1 Rapid ResaPolymyxin Acinetobacter/Pseudomonas NP test测试多粘菌素耐药Pa和Ab的代表性结果。左一图为未添加刃天青的NP测试图，图二为刚添加刃天青的NP测试图，图三为培养后的结果判定图。NP测试分为2列和四行（A、B、C、D），其中，仅第二列添加多粘菌素，第一列作为生长对照；第一行不加菌液作为空白对照，第二行加入敏感株作为阴性对照，第三行加入耐药株作为阳性对照，第四行加入待测菌。读取结果时，空白对照颜色仍保持蓝色不变，阴性对照加抗生素孔中受到抑制，维持蓝色不变；阳性对照加抗生素孔，因菌耐药，仍继续生长，颜色从蓝色变为红色。根据此规律，即可对第四行加样孔进行判断。

表1 本研究提出的NP测试对Pa和Ab的药敏检测结果与BMD的测定结果的比较

原文链接：https://doi.org/10.1128/JCM.01563-18.