使用多级环形功能化碳纳米管阵列对复杂生物样品进行快速分离和超灵敏检测的无缝集成

原创

来源：杨融

2024-08-16 16:18:35

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核心提示：设计了一种用于复杂生物样品分离和多标记物检测的无缝集成的多级环形功能化碳纳米管阵列装置，实现了快速、超灵敏、多靶点分离杂质和捕获生物标志物的能力（1 mL 样品成本时间为 2.5 s），该材料和系统为实时诊断提供了一个扩展的平台。

细菌污染物及其产生的相关毒素可导致并发症，如伤口感染、食源性疾病、痢疾、败血症，甚至死亡，在全球范围内构成巨大挑战。因此，对不同培养基中的细菌进行高效分离、富集和检测对于鉴定细菌性疾病及其传播途径至关重要。

近年来，具有超高孔隙率（>99%）和良好渗透率（1 × 10⁻¹³ m²）的森林结构碳纳米管阵列（carbon nanotube arrays，CNTA）的发展在快速有效地分离和吸附细菌及其生物标志物方面显示出相当大的潜力。厦门大学任磊教授团队设计了一种基于功能化CNTA的多级环形装置，发表了名为Seamless Integration of Rapid Separation and Ultrasensitive Detection for Complex Biological Samples Using Multistage Annular Functionalized Carbon Nanotube Arrays的论文。

该论文旨在引入了精确的离心力来调节 CNTA 内的流体动力学，从而提高了分离效率并适应了各种样品体积，并实施了基于适配体的识别机制来选择性地捕获不同的细菌生物标志物，在三层环形功能化CNTA设备上对金黄色葡萄球菌、细胞外囊泡（EV）和肠毒素蛋白（EP）进行综合分离、积累和多级检测。

该系统检测细菌的机制如图1所示：

研究人员使用基于尺寸的物理分离对环状CNTA的第一层进行分离，以分离细菌、细胞和其他较大的干扰物。同时利用5,5′-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和适配体共修饰金纳米棒（AuNR）作为表面增强拉曼散射（SERS）标签。随后使用带有SSA的SERS标签，通过靶向广泛分布在细胞壁表面的金黄色葡萄球菌蛋白A和EV来精确识别金黄色葡萄球菌及其EV。通过靶向肠毒素（金黄色葡萄球菌的主要外毒素之一），使用带有SEA的SERS标签来鉴定EP。高度增强的SERS信号提供了痕量生物标志物的定量检测。

图1

首先，为了证明细菌及其标记物的有效分离和积累，图2A显示了使用第一层环形CNTA分离时，大物质在类似森林的CNTA内被机械分离，而小物质则穿过它们。图2B证明金黄色葡萄球菌被有效地捕获在第一环状CNTA中。而图C是为了进一步验证了该装置的过滤性，选择不同尺寸的物质进行分离，表明尺寸小于CNTA间隙的物质可以很容易地通过，而尺寸较大的物质在第一环形阵列中被过滤掉。

图2

随后，为了证明该装置的检测性能，以金黄色葡萄球菌为模型细菌，建立了细菌浓度与SERS信号强度之间的线性依赖关系。CNTA通过物理过滤或适配体捕获将细菌生物标志物从相应的阵列区域分离出来后，适配体修饰的SERS标签实现二次捕获，形成三明治结构（图2D、E），显示SSA-SERS标签特异性识别金黄色葡萄球菌。

1. 准确性验证：

为了定量检测该装置捕获的金黄色葡萄球菌浓度，研究人员制备了一系列浓度范围为 1至10⁶ 的细菌样品CFU ml⁻¹，并在器件的三个环形CNTA表面检测到SERS信号。如图2F-H所示，SERS信号强度随着细菌、囊泡或肠毒素浓度的降低而降低，且即使细菌浓度低至 10 CFU mL⁻¹，仍然观察到可区分的SERS信号，表明基于该设备灵敏性。

此外，图2I证明了SERS信号强度峰检测在浓度范围为 10 至 10⁶CFU ml⁻¹均显示出与生物标志物浓度之间的高度线性正相关。

2. 可靠性验证：

图3

为了进一步验证多层环形CNTA装置的检测性能和可靠性，金黄色葡萄球菌的浓度（25、100、500、2500和25 000 CFU mL⁻¹）以 1：1 的体积添加到兔血样中以进行进一步检测。结果如图3A所示，三层CNTA检测的SERS信号热图在检测区域呈现出均匀的强度分布表明了定量检测的可靠性，且随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增大。将SERS强度按照浓度的线性关系转换为细菌浓度后结果一致（图3B）。

3. 特异性验证：

如图3 C 所示了对该装置的特异性验证，通过与250 CFU mL^-1的大肠杆菌、罗伊氏乳杆菌和铜绿假单胞菌做对照组，结果表明 3个对照组的信号强度与噪声信号强度无差异，明显低于金黄色葡萄球菌、EV和EP，表明该装置具有优异的特异性。

4. 实际应用

研究人员选择构建兔菌血症模型，并通过提取外周血进行检测。对菌血症和正常兔的兔血样进行了实际测试比较，结果如图3D所示。菌血症兔模型外周血表现出较强的SERS信号，而正常兔的外周血中没有明显的检测信号。这些结果表明，该装置即使在低浓度下也能有效检测真实兔血浆样品中的菌血症，显示出其在复杂样品中的巨大检测潜力。

综上所述，该研究使用集成的多层环形功能化CNTA设备成功实现了复杂生物样品的分离、积累和SERS检测。该设备的可重复使用性增加了其实际应用的潜力，并显著缩短了总体检测时间。此外，该装置允许包含额外的环形 CNTA 层和针对不同实际应用的定制修饰，从而扩展其多功能性以进一步扩展以识别和分析各种细菌进行痕量检测，并有可能为推进细菌污染定量分析领域做出贡献。

参考文献：https://doi.org/10.1002/adma.202312518