摘要：连续血糖监测仪对糖尿病管理至关重要，但侵入性采样、信号漂移和频繁校准限制了其广泛使用。微针传感器是一种微创平台，用于实时监测间质液的临床参数。本文采用机械强度强的微针底座和薄层荧光水凝胶传感器构建无痛柔性微针传感贴片，实现现场、准确、连续的血糖监测。福斯特共振能量转移(FRET)为基础的水凝胶传感器是由丙烯酸酰化FRET对和葡萄糖特异性苯硼酸的光聚合制备的。优化的水凝胶传感器使葡萄糖定量具有可逆性，高选择性和抗光漂白信号稳定性。聚(乙二醇二丙烯酸酯)-共聚物丙烯酰胺水凝胶被用作微针基础，促进有效的皮肤穿刺和生物流体提取。集成微针传感器贴片在(病理)生理范围内的灵敏度为0.029 mM⁻¹，低检出限为0.193 mM，在人血清中的响应时间为7.7 min。在猪皮肤模型中连续监测6小时模拟进食和休息活动中的低血糖、正常血糖和高血糖。这种具有高透皮分析性能的微针传感器为在护理点设置中持续监测糖尿病提供了强大的工具。

图1. 用于连续ISF监测的微针荧光传感器。a，三层微针传感器的皮肤插入示意图及其在ISF中与分析物的可逆相互作用。b，荧光水凝胶传感器的FRET对和功能单体的光聚合及其与葡萄糖的可逆相互作用，导致比例荧光变化。

在此，我们开发了一种基于水凝胶的可穿戴微针贴片，用于微创、连续和准确的ISF血糖监测，具有可逆、定量和比例荧光读数。如图1a所示，可穿戴分析贴片由三层组成:1)基于FRET的荧光化学传感器层，用于连续测定葡萄糖;2)机械强度强的聚(乙二醇二丙烯酸酯)-共聚丙烯酰胺(PEGDA-PAM)水凝胶微针基层，用于有效的皮肤插入;3)柔性疏水性聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)衬底层抑制环境干扰。如图1b所示，两种丙烯酰化罗丹明和荧光素衍生物(FAA和RhB)被设计为水凝胶传感器中的FRET供体和受体，它们作为从FRET对到荧光信号距离的信号换能器。

首先通过在PBS缓冲溶液中以不同比例混合FAA和RhB来评估FRET供体和受体之间的能量转移(图2a)。在470 nm激发下，观察到典型的双峰荧光发射光谱，供体FAA (ID)和受体RhB (IA)的最大发射峰分别在510 nm和585 nm处。RhB添加量的增加明显降低了供体辐射，表明了水溶液中有效的能量传递。将恒摩尔比的FAA和RhB混合物逐渐稀释，研究浓度对FRET过程的影响(图2b)。稀释20倍后，RhB和FAA的FRET比值R = IA/ID从0.57降至0.40，证实了供体-受体距离延长对FRET效率的负面影响。通过调节FAA:RhB的摩尔比= 1:2、2:2、4:2，制备了F1R2、F2R2和F4R2水凝胶传感器。图2c展示了F4R2葡萄糖传感的定量分析，显示出对葡萄糖水平的明显荧光响应。将F1R2、F2R2和F4R2的FRET比率绘制为葡萄糖浓度[Gluc]的函数，以比较它们的灵敏度(图2d)。F4R2的FRET比值变化最大，为0.75，而[Gluc]变化为60 mM，表明F4R2的灵敏度最高。在保持FAA:RhB = 4:2的同时，调节3-APB的摩尔分数以提高灵敏度(图2e)。将3-APB的摩尔分数从10%增加到40%，显著降低了聚合物网络的亲水性，从而缩短了FRET对的距离，导致水凝胶的红移发射(图2f)。

图2. 光聚合配方的优化。

为了表征优化后的葡萄糖响应水凝胶传感器(1×1cm²)，将其浸泡在不同pH(6.0-9.0)、不同葡萄糖浓度(0-24 mM)的PBS缓冲溶液中，通过酶标仪收集其发射光谱。如图3a所示，随着葡萄糖浓度的升高，水凝胶传感器在520 nm处发光增加，在595 nm处明显下降，是典型的基于FRET的比例荧光变化。定量FRET分析表明，在较高的葡萄糖浓度下，FRET比率(R=I₅₉₅/I₅₂₀)的相应下降速度较慢，同时荧光颜色从红橙色逐渐变化为黄绿色(图3b)。收集水凝胶传感器在不同葡萄糖浓度(0、5、10 mM)下的发射光谱，测定pH值在6.0 ~ 9.0之间的影响。以5 mM [Gluc]处的发射光谱为例，两个发射峰都随着pH值的增加而增加(图3c)，这与碱性条件下荧光素荧光量量子率的提高有关。图3d进一步比较了不同葡萄糖浓度下pH响应的FRET比率(I₅₉₅/I₅₂₀)。通过分析FRET比值的垂直变化，三条曲线的距离逐渐延长，表明在高pH下葡萄糖敏感性增加。此外，设置25-37℃的温度范围，以研究温度对葡萄糖传感的影响，并显示传感器在环境和皮肤温度(33.5-36.9℃)上的适用性。图3e显示了水凝胶传感器在33℃时[Gluc]变化时记录的发射光谱，在25℃时显示了几乎相同的模式。图3f中FRET比值与[Gluc]的近似平行拟合曲线代表了在不同温度下的稳定灵敏度，表明温度对葡萄糖-硼酸阴离子相互作用的影响可以忽略不计。

图3. 优化后的荧光水凝胶传感器的表征。

为了将葡萄糖选择性荧光水凝胶传感器整合到可穿戴平台中，设计了一种双层微针贴片，用于有效的皮肤ISF采样和快速葡萄糖扩散(图4a)。将水凝胶传感器预聚合溶液浇铸后，在PDMS模具中对PEGDA-PAM微针基，得到两层微针传感器贴片。制备了不同摩尔分数PEGDA交联剂(50-90%)的PEGDA-PAM薄膜，以优化其力学性能。所有PEGDA-PAM薄膜在整个负载范围内都表现出典型的共价交联聚合物网络的构象熵驱动弹性行为(图4b)。通过计算应力-应变曲线线性区域的梯度，得到两种试验的模量如图4c所示。压缩模量和拉伸模量的变化趋势与PEGDA的摩尔分数呈正抛物线关系。PEGDA-PAM微针的尺寸差异与针体积变化趋势相关，其中溶胀率与交联密度呈反比关系(图4e)。优化后的微针基高为334±3 μm，半径为271±1 μm，针尖间距为546±1 μm(图4f和g)，整个微针阵列的平均针尖面积为0.75 mm²(图4f)。水凝胶传感器与微针底座紧密结合，在去离子水中浸泡3天后未发现层分离，表明两层聚合物网络相互渗透交联。两层微针传感器高度增加到446±7 μm，半径增加到281±3 μm，间距没有明显变化(图4h)。进一步对微针底座和微针传感器施加0.1 mm min⁻¹的50 N载荷进行压缩试验(图4d)。载荷力随位移的逐渐增加表明微针在压缩下的响应是稳定的。两根微针的力-位移曲线均未观察到明显变化，表明在0.4 N /针范围内没有实际的针失效。这表明其出色的插入能力克服皮肤弹性，因为人体皮肤的阻力估计为0.03 mN。

图4. 微针贴片的制备及力学优化。

由于基于FRET的水凝胶传感器的葡萄糖检测和PEGDA-PAM微针的机械强度都得到了很好的优化，因此在对微针传感器贴片进行生物相容性评估后，需要研究微针传感器贴片的连续血糖监测和足够的皮肤穿透性(图5a)。从分步制作过程和在猪腹部皮肤上的插入测试可以看出，集成微针传感器贴片具有柔韧性和机械鲁棒性，可穿透皮肤，插入深度为266 μm(图5b)。如图6c所示，当葡萄糖浓度从0增加到24 mM时，集成微针传感器仍然显示FRET供体在520-524 nm处的峰值强度增加，而FRET受体在591-594 nm处的峰值强度下降。FRET比值R=I₅₉₄ /I₅₂₂与[Gluc]的图与Eq.(1)给出的s型校准曲线高度相关(图5d)。该集成微针传感器在人体ISF [Gluc]范围内的LOD为0.193 mM，平均灵敏度为0.029 mM⁻¹。在人工ISF中校准微针传感器后，使用预处理的人血清([Gluc] = 5 mM)来评估存在许多非特异性相互作用时的葡萄糖传感能力。随着外源葡萄糖的逐渐加入，微针传感器在5倍稀释的预处理血清中的FRET比率被连续记录(图5e)。血清培养基中FRET比率的类似趋势表明微针葡萄糖传感器在复杂生物基质中的高鲁棒性。微针传感器贴片的响应时间在每引入4 mM[Gluc]梯度时从5.5到11.0 min不等，验证了其有效增强限速葡萄糖扩散。这种变化是通过两层水凝胶微针贴片的战略设计实现的，减少了荧光水凝胶传感器的厚度。与图5f相比，预测值[Gluc]与参考值[Gluc]成线性比例。预测精度的均方误差(MSE)为0.109，平均绝对误差(MAE)为0.289，表明微针传感器的预测误差较小。生物基质对背景干扰的高抗性促进了临床葡萄糖监测的实际应用。此外，在带有荧光色图的微针传感器上再覆盖一层透明PET薄膜，并涂上丙烯酸粘合剂，以确保在离体猪皮中葡萄糖浓度的原位测量(图5g)。在[Gluc]= 0 mM人工ISF预处理的猪皮(约700 μm)随后用于测试传感器对日常活动中预期的不同葡萄糖水平的响应。采用5、10、5、20、5、15、5 mM的葡萄糖浓度来模拟糖尿病患者的饮食和休息行为。在猪皮肤模型中实现了6 h低血糖、高血糖和正常血糖的动态监测。微针传感器在2-20 mM的临床相关范围内对葡萄糖浓度表现出良好的动态响应，这显示出准确量化糖尿病患者餐前和餐后葡萄糖浓度的潜力。

图5. 用于连续血糖监测的可穿戴微针传感器贴片。

总结：

1. 利用丙烯酰化FRET对和葡萄糖特异性苯硼酸的光聚合制备并优化了基于FRET的水凝胶传感器。

2. 所制备的非酶水凝胶传感器具有良好的分析性能，重复性可达15倍以上，对ISF中常见干扰物质具有高选择性，抗光漂和浸出信号稳定。

3. 该集成微针传感器在人工ISF中的LOD为0.193 mM，在人ISF [Gluc]范围内的灵敏度为0.029 mM⁻¹，在人血清[Gluc]变化时的平均响应时间为7.7 min。在离体猪皮肤上连续监测6小时模拟进食和休息事件中的低血糖、正常血糖和高血糖水平。

4. 微针荧光传感器贴片有望通过满足患者在护理点环境中对一致性、准确和实时监测的需求，促进下一代诊断。

参考文献：

Hu, Yubing, et al. "A wearable microneedle patch incorporating reversible FRET-based hydrogel sensors for continuous glucose monitoring." Biosensors and Bioelectronics 262 (2024): 116542.