由细菌、病毒、真菌甚至寄生虫引起的呼吸道感染严重威胁人类公众健康。其中，细菌是主要致病因；因其感染症状与病毒感染症状极为相似，以及实验室诊断数据的延迟，常使临床无法给出针对性药物治疗方案而转向可能无效的经验性用药。另外，呼吸道感染具备传播能力强和发病率高的季节性特点，而这常给医疗机构带来巨大的病原检测负担。因而迫切需要开发快速、准确、易于使用的高通量呼吸道病原菌诊断筛选方法。近年来，基于核酸的检测技术因其在检测周期、特异性、灵敏度上的显著优势，在病原诊断领域内得到了广泛的应用和发展。其中，CRISPR技术的引入，又进一步提高了核酸检测技术的灵敏度、特异性和稳健性。通过CRISPR/Cas系统靶向识别特定的目标序列，可以触发Cas蛋白对相关荧光报告分子的切割。现今，已开发出不少结合了核酸扩增技术和CRISPR的POCT平台应用于病原菌的高精度检测。不过，这些平台大多涉及到“脱节”的操作步骤，例如核酸的纯化，与真正的POCT还存在一段距离；另外，大多平台仍然靶向单一靶标，而实际感染常涉及到多个病原。基于此，相欣然等人开发了一个自动离心式微流控系统（AMIC），集成了核酸提取、RAA-CRISPR扩增和信号读出，在一次实验中实现六重检测。实验操作流程见图1，痰液样本收集后在经简单的样本预处理后，直接加入离心式微流控芯片中，随后依次完成基于Chelex-100的核酸提取、RAA扩增DNA、T7 RNA聚合酶介导的DNA序列的转录以及Cas13a酶的启动和荧光信号分子的切割，最后通过收集荧光信号实现病原鉴定。鉴于集成化的需求，作者对核酸提取以及后续3个步骤（DNA扩增、转录及RNA信号分子切割）进行了优化，以确定最佳实验方案。另外，为实现POCT，作者探索了试剂冻干的策略，以避免在运输过程中带来的不确定损耗。基于优化后的实验条件，作者首先通过向健康人群中获得的痰液中人工加入12种目标病原菌（10¹-10⁷ CFU/mL），展示了本方法对不同病原的线性检测范围（图2A）；在这里，也利用其它56种呼吸道病原验证了方法的特异性（图5B）。然后，作者利用60例临床样本（48例阳性，12例阴性）评价了方法的实际应用价值，并将检测结果与临床培养结果及qPCR结果进行比较（图2C）。结果显示，AMIC系统能够准确地检测到阳性样本中的68个目标病原（100%敏感性），未出现任何假阳性结果（100%特异性）（图2D）。相较之下，qPCR仅在45例样本中检测到了57个目标病原（准确率为83.82%；灵敏度为93.75%），且qPCR的阳性样本Ct值为16.36~33.78。也即，本研究建立的AMIC系统比qPCR检测更敏感，且整个检测周期仅需40 min，能够同时实现多种病原检测，更具优势性（图2E）。

总的来说，作者构建了具有高转换效率的协调RAA-CRISPR检测策略，并将其集成到AMIC系统中，成功应用于12种呼吸细菌的同时检测。AMIC系统的高度集成化最大限度地减少了手动操作可能带来的错误/误差，显著缩短了实验周期（40 min）。另外，此集成系统采用冻干方案以简化分析工作流程，并在不牺牲灵敏度的情况下保证了其在短时间（10天）运输中的稳定性。含冻干试剂的AMIC系统对12种呼吸道感染目标菌具有良好的特异性，且在10¹-10⁷ CFU/mL范围内能够实现目标病原的准确定量。此外，所开发的方法具有较强的经济效益性，单次实验成本约2.5美元，具有较强的临床应用潜力。

图1 AMIC系统工作流程及协调RAA-CRISPR检测设计。

图2 AMIC系统检测12种呼吸细菌的分析性能。（A）Tt值与浓度之间的半对数回归。（B）AMIC系统的特异性。（C）使用qPCR、培养方法和AMIC系统的并排临床样本检测示意图。（D）针对60份痰标本的AMIC系统检测结果与qPCR结果的一致性评价。（E）AMIC系统的临床样本检测结果。

 原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c05682