基于dCas9介导的双功能Au@Pt纳米酶链组装构建比色和SERS双信号平台用于沙门氏菌的快速检测

原创

来源：冯燕梅

2024-08-29 09:20:50

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核心提示：失活的Cas9（dCas9）作为Cas9的一种突变体，缺乏切割活性，但仍能识别目标DNA中的单核苷酸多态性。利用dCas9的特异性识别能力以及LAMP的高扩增效率，能够在提高检测灵敏度的同时降低非目标扩增引起的背景信号。

沙门氏菌是引起细菌性食源性疾病的主要病因之一。由于其传染性极低且流行率极高，迫切需要可靠的沙门氏菌检测早期预警方法。等温扩增技术，特别是环介导等温扩增（LAMP）能够在30分钟内在恒温下将目标核酸扩增10⁹倍，且对实际样品基质具有相当大的耐受性，是即时检测应用中受欢迎且有前途的工具。然而，来自复杂样品的外源基因引起的非目标扩增可能会增加背景信号，甚至导致假阳性，从而降低基于LAMP方法的准确性。此外，这些单信号检测通常易受环境和操作者偏差的影响，导致结果不可靠。

基于此，安徽医科大学王华教授等报道了一种失活的Cas9（dCas9）介导的比色和表面增强拉曼散射（SERS）双信号平台（dCas9-CSD）用于准确检测各种食品中的沙门氏菌。如图1所示，将双功能金-铂纳米酶（Au@Pt）作为报告单元，在沙门氏菌存在的情况下，首先用LAMP扩增目标基因，生成生物素标记的双链DNA扩增子。扩增子的重复序列片段包含一个特定结合区域和一个原间隔邻近基序（PAM），dCas9/sgRNA复合物可准确识别LAMP扩增子，并释放非互补侧的单链序列。释放的序列可与Au@Pt-DNA探针杂交，而生物素标记的LAMP扩增子可通过生物素-链霉亲和素相互作用结合到链霉亲和素修饰的磁珠（SA-MB）上，导致Au@Pt在SA-MB表面形成链状组装。磁分离收集到的Au@Pt纳米酶通过Pt铂壳层将无色TMB氧化为蓝色oxTMB，然后通过Au核增强oxTMB的拉曼信号。利用比色和SERS信号的交叉验证，提高了分析结果的可靠性。LAMP反应和Au@Pt纳米酶催化组成的两轮信号放大提高了检测的灵敏度，而dCas9介导的LAMP扩增子的二次识别大大提高了检测特异性和稳定性。

图1 dCas9介导的双信号模式检测沙门氏菌的原理图。

研究要点：

（1）Au@Pt纳米酶的制备及表征。

（2）Au@Pt探针共轭物制备。

（3）dCas9-CSD检测平台的可行性验证。

（4）dCas9-CSD检测平台的性能验证。

（5）实际样品中沙门氏菌的检测。

主要结果：

图2（A）Au和（B）AuPt的TEM图像，插图为对应的照片；（C）AuPt催化TMB氧化的紫外吸收光谱，插图为相应的比色图像；（D）Au@Pt催化TMB氧化的拉曼光谱，不同剂量H₂PtCl₆的（E）紫外吸收光谱，（F）实时吸光度值，（G）拉曼强度值；（H）相应的吸光度值和拉曼强度端点值。TMB：1.25 mM。

图3（A）LAMP扩增子、dCas9和sgRNA不同组合的电泳表征；（B）LAMP扩增子、hdCas9和sgRNA不同组合的电泳表征；（C）Au@Pt和（D）Au@Pt+扩增子+dCas9/sgRNA的TEM图像；（E）SA-MB和（F）SA-MB+扩增子+dCas9/sgRNA+Au@Pt探针的SEM图像；dCas9-CSD采集的用于沙门检测的（G）紫外吸收光谱和（H）拉曼光谱，插图：相应的比色图像；TMB：1.25 mM。

图4 不同浓度沙门氏菌对（A）裸眼图像；（B）紫外-可见吸收光谱；（C）拉曼光谱的响应；（D）比色信号和拉曼强度随沙门氏菌浓度的变化图；（E）dCas9-CSD对沙门氏菌的特异性检测（1）沙门氏菌；（2）枯草芽孢杆菌；（3）大肠杆菌；（4）痢疾志贺氏菌；（5）金黄色葡萄球菌；（6）假丝酵母；（7）铜绿假单胞菌；（8）六种非目标菌；（9）沙门氏菌+枯草芽孢杆菌；（10）沙门氏菌+大肠杆菌；（11）沙门氏菌+痢疾志贺氏菌；（12）沙门氏菌+金黄色葡萄球菌；（13）沙门氏菌+假丝酵母；（14）沙门氏菌+铜绿假单孢菌；（15）沙门氏菌+六种非目标菌；（16）空白；插图：相应的图像。（F）SERS稳定性测试和比色测量；（G）dCas9-CSD的重复性测试。

图5 通过dCas9-CSD方法在真实样本中检测不同浓度的沙门氏菌（A）湖水；（B）卷心菜；（C）橙汁；（D）牛奶；（E）啤酒；（F）鸡蛋。

研究结论：

本研究成功构建了一种dCas9介导的SERS和比色双信号平台用于沙门氏菌的灵敏检测。该平台优势总结如下：（1）dCas9介导的LAMP扩增子二次识别减少了非靶标扩增引起的背景信号，从而提高了特异性和稳定性；（2）LAMP扩增和Au@Pt催化提高了灵敏度，使两种模式下的LOD降至1 CFU/mL；（3）交叉验证的比色和SERS信号确保了分析的可靠性；（4）裸眼快速定性分析和智能手机准确定量分析增强了方法的整体弹性，满足用户在不同场景下的定性或定量需求；（5）整个检测实验可在50分钟内完成。进一步的改进考虑以下方面：首先，该检测平台需要开盖和多步操作步骤，可能会造成气溶胶污染的风险；其次，该平台无法同时检测多种病原菌，这是实际应用中迫切需要的。因此，多步多通道微流控器件的发展有望解决这些缺点。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c01474